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对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的宿主范围广泛,能感染绝大多数的虾蟹类,是虾蟹类水产养殖业的主要病原,传染力强,致死率高,给全球水产养殖业造成了巨大的经济损失。由于对WSSV的致病机理知之甚少,至今为止仍未找到一个行之有效的方法根治WSSV。在课题组的前期研究中,从WSSV感染的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)造血组织(Haematopoietic tissue,Hpt)细胞差异基因表达谱中筛选到了两种抗脂多糖因子(Anti-lipopolysacride Factor,ALF),一种为诱导上调表达的 CqALF,另一种为表达量无显著变化的CqALF2。本论文利用红螯螯虾Hpt细胞体外培养系统、荧光定量PCR、电镜观察和重组蛋白真核表达等技术初步探究了CqAL 的抗病毒机理。取得成果如下:(1)克隆获得了红螯螯虾CqALF基因cDNA全长序列(GenBank登录号:KX083340)和CqALF 的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列。CqALF基因cDNA全长序列包括ORF 372 bp,5’非编码区108 bp,3’非编码区383 bp。其ORF编码123个氨基酸,预测蛋白分子量大小为13.35 kDa。CqALF2的ORF为372 bp,编码123个氨基酸,预测蛋白大小约为13.86 kDa。螯虾两种ALF均具有两个半胱氨酸连接的保守的LPS结合位点(LPS Binding Domain,LBD),预测的信号肽位置为前25个氨基酸。(2)阐明了 CqALF基因在健康螯虾各组织器官的分布情况,结果显示CqALF分布于检测的所有组织器官中,在胃、上皮和眼柄中表达量最高。(3)为鉴定CqALF的生物学活性,优化真核表达和纯化工艺获得CqALF重组蛋白 rCqALF。利用最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)法检测 rCqALF对所测试20种菌的抗菌活性。rCqALF对荧光假单胞菌等四种革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等四种革兰氏阳性菌具有明显的抑杀活性,其中对弗氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的杀菌活性较高,弗氏志贺氏菌的MBC小于6μM,而金黄色葡萄球菌则小于12μM。(4)rCqALF可以与WSSV囊膜蛋白互作,破坏病毒囊膜结构,继而降低WSSV对宿主的感染率。电镜观察下rCqALF显著破坏病毒囊膜结构,荧光定量检测结果显示rCqALF使得WSSV对体外Hpt细胞的感染率显著下调,并且rCqALF提高了螯虾活体抵御WSSV感染的保护力。本研究揭示了CqALF在螯虾免疫系统中发挥关键作用,不仅具有广谱抗菌活性,并且可以直接破坏WSSV囊膜蛋白达到抗病毒效果,为甲壳动物抗WSSV新药的研发提供了新的思路。