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影响肿瘤发生、发展的机制尚不完全清楚。线粒体是细胞内重要的细胞器,参与了细胞内诸多功能的实现,如能量代谢、离子平衡、脂质、氨基酸和核酸的合成、细胞运动、增殖以及凋亡等[1]。线粒体是细胞质重要成分之一,线粒体功能不全是肿瘤细胞最重要的特征之一,线粒体DNA(mtDNA)突变见于多种肿瘤[2,3],且可能与多种肿瘤的发生及肿瘤进展、转移等恶性表型有关。研究表明,正常细胞与转化细胞的线粒体存在显著差异。线粒体损伤是否参与肿瘤的形成,或者它们仅仅是肿瘤发生过程中的继发事件,仍不清楚。将肿瘤细胞浆与正常细胞融合形成的杂交细胞可能表现肿瘤源性特征,提示细胞质成分可能参与了肿瘤的形成。肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是造成肿瘤化疗失败的重要原因。肿瘤细胞多药耐药产生的机制是多方面的,包括糖蛋白转运载体如P-gp/ABCB1、MRP1/ABCC1和BCRP/ABCG2表达增加[4]等。研究发现,线粒体功能不全在肿瘤细胞多药耐药表型的形成中也起作用。mtDNA缺失能诱导肿瘤细胞多药耐药表型产生,然而其机制仍不清楚。为研究线粒体DNA缺失与肿瘤恶性表型的形成以及多药耐药性产生的关系,我们以肝癌细胞株SK-Hep1作为研究对象,经过溴化乙锭培养诱导21代后,成功的建立了mtDNA缺失的细胞株ρ0SK-Hep1。在此基础上我们采用血小板为外源线粒体供体,构建了胞质体细胞SK-Hep1Cyb,对肿瘤细胞生物学行为进行研究,并比较分析ρ0SK-Hep1、SK-Hep1Cyb与SK-Hep1细胞耐药性、P糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP1)以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达差异,初步探讨mtDNA缺失促使肿瘤细胞恶性表型形成以及诱导肿瘤细胞多药耐药产生的可能机制,得到了一些有意义的结果。目的1.线粒体DNA缺失人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1及其转线粒体细胞模型SK-Hep1Cyb的建立及鉴定。2.对比研究SK-Hep1、ρ0SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞生物学行为差别。3.比较分析ρ0SK-Hep1、SK-Hep1Cyb与SK-Hep1细胞耐药性、P糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP1)以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达差异。方法1.线粒体DNA缺失人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1的建立,线粒体DNA缺失人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1转线粒体模型的建立及鉴定。采用溴化乙锭(EB)诱导,建立线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1,以正常人血小板为外源性线粒体供体,采用聚乙二醇融合方法建立ρ0SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb,PCR、Southern杂交、Western blotting进行鉴定。2.ρ0SK-Hep1、SK-Hep1Cyb与SK-Hep1细胞生物学行为差别的比较及其机制初步探讨,以MTT法、Transwell细胞侵袭实验观察三种细胞的生长、侵袭状态,MTT法检测药物敏感性。3. Western blot检测细胞中P-糖蛋白(P-gp)、MRP1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果1.细胞融合3天后换用高糖培养基(DMEM)含10%胎牛血清,不含丙酮酸、尿嘧啶进行培养,培养7天后,于培养瓶中可见单个融合细胞克隆形成。PCR结果显示,细胞色素氧化酶I、II(COX I、COX II)及内参G3PDH在SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞中均可扩增出相应的条带,ρ0SK-Hep1细胞只见内参条带的形成。Southern杂交结果显示SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞可见COX I、COX II杂交条带,ρ0SK-Hep1细胞只见内参条带的形成,SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞可见COX II蛋白杂交条带,ρ0SK-Hep1细胞只见内参条带的形成。2.以培养时间为横坐标轴,以细胞培养1～5天的吸光度值为纵坐标轴,绘制生长曲线。由生长曲线可以看出,三种细胞增殖存在明显差异,SK-Hep1Cyb细胞生长最慢,而ρ0SK-Hep1细胞生长最快。SK-Hep1细胞、ρ0SK-Hep1细胞和SK-Hep1Cyb细胞群体倍增时间分别是:(25.24±0.20 h)、(20.91±0.43 h)和(33.44±0.14 h),三者两两比较差异显著(P<0.01)。细胞侵袭试验结果显示,ρ0SK-Hep1细胞侵袭能力最强,穿过细胞数最多,SK-Hep1Cyb细胞侵袭能力最差,低于SK-Hep1及ρ0SK-Hep1细胞。三种细胞相互间差异有显著性(P <0.01)。3.细胞药物敏感性试验MTT结果显示:SK-Hep1、ρ0SK-Hep1、SK-Hep1Cyb细胞对ADM的IC50分别是(0.62±0.02)μg/ml、(4.93±0.17)μg/ml和(0.57±0.02)μg/ml,ρ0SK-Hep1的RI是SK-Hep1的7.95倍,中度耐药;SK-Hep1Cyb的1/RI是SK-Hep1的1.05倍,无明显耐药性;ρ0SK-Hep1细胞与亲本细胞相比对DDP低度耐药,与SK-Hep1Cyb细胞相比对DDP中度耐药;三种细胞相比对VCR、5-FU耐药性无明显差异。4. SK-Hep1细胞和ρ0SK-Hep1细胞MRP1条带亮度接近,均强于SK-Hep1Cyb细胞。ρ0SK-Hep1细胞P-gp蛋白表达明显增强,ρ0SK-Hep1细胞Bcl-2蛋白表达明显增强,而SK-Hep1Cyb细胞与SK-Hep1细胞相比差异不明显,Bax蛋白表达在ρ0SK-Hep1细胞最强,SK-Hep1Cyb细胞稍弱,SK-Hep1细胞相对最弱。Bcl-2与Bax条带灰度的比值(Bcl-2/Bax)在ρ0SK-Hep1细胞最高(0.61±0.03)而SK-Hep1Cyb细胞则最弱(0.43±0.05)。结论1.成功的构建了线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1及其转线粒体细胞株SK-Hep1Cyb。除了PCR以及Southern杂交等验证线粒体DNA缺失及转入线粒体成功外,我们还从蛋白水平上进行了进一步验证。2.线粒体DNA缺失的ρ0SK-Hep1细胞生长速度加快,侵袭能力增强,而转入正常线粒体后生长速度降低,侵袭能力下降。3.线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ0SK-Hep1细胞对阿霉素和顺铂产生比较明显的耐药性,而转入正常线粒体后恢复了对阿霉素和顺铂的敏感性。4.经初步研究发现多药耐药产生的原因可能与细胞内线粒体DNA损伤或缺失后,细胞内多药耐药蛋白P-gp、MRP1表达增加,细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2表达增加和Bcl-2/Bax比值增加有关。