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蚕豆(ViciafabaL.)籽粒富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质。在发芽过程中,蚕豆籽粒内源酶系统被激活,蛋白质、碳水化合物等贮藏性物质被分解成易于吸收利用的小分子物质,对人体具有生理作用的γ-氨基丁酸(GABA)等功能性物质生成或得以富集,同时抗营养因子降解。植物中GABA由GABA支路和多胺降解途径合成,其中谷氨酸脱羧酶(GAD,EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO,EC1.4.3.6)分别是这两条途径中合成GABA的限速酶。发芽蚕豆在低氧胁迫下激活GAD和DAO,GABA大量积累。Ca2+和脱落酸(ABA)对植物逆境信号的传递起重要作用。本文研究了发芽蚕豆中GAD和DAO酶学特性,揭示了低氧及其联合NaCl胁迫下Ca2+和ABA对GABA富集的影响机制。主要研究结果如下: 1、研究了蚕豆发芽过程中GAD及DAO的变化情况以及纯化后的酶学特性。在5d的发芽过程中,GAD活力在胚根中上升较快,且活力最高;DAO活力在胚芽中急剧上升。30℃和酸性条件下发芽更利于提高GAD和DAO活力;氨氧乙酸和氨基胍(AG)分别显著抑制GAD和DAO活力,其抑制率随浓度的增加而提高;6.0mmol/LCaCl2均可提高发芽蚕豆中GAD和DAO活力,而0.5mmol/LEDTA-Na2显著抑制GAD和DAO活力,GAD和DAO可分别被90mmol/L的PLP和CuCl2激活。发芽5d的蚕豆中GAD和DAO经纯化后,SDS-PAGE电泳测得其亚基分子量分别为58kDa及52kDa。两者最适反应温度均为40℃,最适反应pH分别为6.0和6.5。GAD活力被Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、氨氧乙酸、EGTA、EDTA-Na2、L-半胱氨酸(L-cys)和β-巯基乙醇显著抑制,而被低浓度Ca2+(0.2mmol/L)激活;DAO活力被Mg2+、Cu2+和Fe3+、AG、EGTA、EDTA-Na2、L-cys和β-巯基乙醇抑制。GAD对Glu的Km为2.63mmol/L;DAO对腐胺(Put)和亚精胺(Spd)的Km分别为0.23mmol/L和0.96mmol/L,而对Spm无降解作用。 2、研究了蚕豆发芽3d和5d时GABA富集情形。非胁迫发芽时,随发芽时间的延长,蚕豆中GABA含量及DAO无显著变化,GAD活力在发芽5d时显著提高(P<0.05),Glu及PAs含量呈上升趋势。低氧胁迫提高了发芽蚕豆GAD和DAO活力,Glu和PAs与GABA含量显著提高(P<0.05)。当发芽5d时,GABA含量提高了3.27倍,其中子叶和胚中分别提高了1.10及17.14倍。解除低氧胁迫促使GAD活力显著升高和DAO活力显著下降,同时GABA、Glu及PAs含量显著降低(P<0.05)。低氧胁迫下用AG处理后,DAO活力被抑制,阻止PAs向GABA转化,导致PAs积累。当处理3d和5d时,GABA分别减少了30.30%和30.80%。 3、低氧处理和NaCl胁迫对发芽蚕豆GABA的富集具有叠加作用,且达到最高含量的胁迫时间缩短;解除NaCl、低氧处理3d后,GABA含量高于低氧联合NaCl胁迫处理者。低氧联合NaCl胁迫下加入AG后,发芽3d的蚕豆中GABA含量减少了29.82%。低氧联合NaCl处理强烈抑制GAD活力,且抑制DAO活力的时间滞后。解除胁迫后蚕豆子叶中GAD与DAO活力显著提高。低氧条件下加入NaCl增强了胁迫强度,增加的GABA主要是多胺降解途径贡献的。解除胁迫后PAs积累。 4、研究了Ca2+对低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集GABA的调节作用。6.0mmol/LCaCl2使发芽蚕豆子叶、胚芽及胚根中GABA含量分别提高了14.68%、19.30%和8.51%,EDTA显著降低GAD与DAO活力,导致GABA富集量的降低(P<0.05)。Ca2+显著激活胚芽中GAD,对子叶和胚根则无显著影响(P>0.05);在Ca2+处理基础上加入AG,使子叶和胚根中GAD活力增加,胚芽中GAD活力则下降,而各部位DAO活力下降,其中胚芽DAO活力被抑制(P<0.05)。低氧联合NaCl胁迫下CaCl2处理后,胚根中Glu含量提高幅度最大,子叶次之,胚芽最小。EDTA处理显著降低子叶和胚芽中Glu含量,胚根中则显著升高(P<0.05)。6.0mmol/L的CaCl2显著提高Put含量,EDTA加入后抑制了DAO活力,从而促进Put累积。 5、研究了低氧联合NaCl胁迫下ABA对发芽蚕豆富集GABA的调节作用。ABA处理促使GAD和DAO活力升高(P<0.05),同时GABA和Glu的累积具有显著作用(P<0.05)。在ABA处理基础上加入AG后,子叶和胚芽中Glu分别降低了35.15%和29.85%;ABA处理后,发芽蚕豆子叶、胚芽以及胚根中Put含量分别提高83.92%、125.79%和100.76%;在ABA处理基础上添加AG后,子叶和胚根中Put含量继续升高。ABA可显著提高Spd和Spm的累积量。氟草酮(Flu)处理显著降低子叶和胚芽GAD活力以及子叶DAO活力,胚芽和胚根中GABA含量分别降低21.07%和28.88%;在Flu处理基础上添加AG后,发芽蚕豆胚芽和胚根中DAO活力分别降低26.58%和11.26%,对发芽蚕豆中Glu含量无显著影响(P>0.05);Flu导致Put和Spm累积,Spd含量则显著下降。 6、采用RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)技术,设计兼并引物、3和5端特异性引物,克隆发芽蚕豆GAD和DAO基因。将中间片段、上游及下游cDNA序列拼接,分别得到1787bp和2199bp的GAD与DAO基因序列(包含部分内含子)。运用DNAStar和BioXM在线软件分析上述序列,发现GAD基因序列包含有1527bp开放阅读框,可编码509个氨基酸(GenBank登录号:JX444699);DAO基因包含有2025bp开放阅读框,可编码675个氨基酸(GenBank登录号:JX444698)。 7、研究了低氧联合NaCl胁迫处理下GABA富集与GAD和DAO基因表达的关系。低氧或低氧联合NaCl处理均显著提高发芽蚕豆GAD和DAO活力,促进GABA的富集。NaCl处理后发芽蚕豆子叶中GABA的富集效果最好。低氧和低氧联合NaCl胁迫处理均促进发芽蚕豆胚根中GAD基因的表达。在低氧胁迫下,发芽蚕豆各部位中DAO基因表达水平反而下调,低氧下AG处理和低氧联合NaCl胁迫处理对子叶和胚芽中GAD基因表达有显著促进作用;当采用低氧联合NaCl胁迫时,发芽蚕豆子叶和胚芽中DAO基因表达水平显著上调。 8、低氧联合NaCl胁迫下外源CaCl2显著提高了发芽蚕豆胚芽中GAD和DAO活力,子叶和胚芽中GABA含量显著提高(P<0.05)。EDTA处理降低了发芽蚕豆各部位GAD和DAO活力,并显著降低子叶和胚根中GABA含量。CaCl2处理显著提高发芽蚕豆子叶中GAD基因表达量,却显著降低胚根中的表达量(P<0.05),对胚芽中的表达量无显著影响。与GAD不同,CaCl2处理显著提高发芽蚕豆胚芽中DAO基因的表达量,对子叶中的表达量无显著影响,却显著降低了胚根中的表达量。EDTA处理显著降低发芽蚕豆子叶中GAD基因表达量,而显著提高胚芽中其表达量,对胚根中无显著影响,但是促进了发芽蚕豆各部位中DAO基因的表达。 9、低氧联合NaCl胁迫下ABA处理使发芽蚕豆GAD和DAO活力显著升高,同时GABA含量显著增加;ABA处理显著降低发芽蚕豆子叶和胚根中GAD基因表达量,但使胚芽中其表达量提高。与GAD基因表达情形不同,ABA处理使发芽蚕豆各部位的DAO基因表达量上升。当采用ABA合成抑制剂Flu处理发芽蚕豆时,GAD和DAO活力被不同程度地抑制,同时GABA富集量显著降低,然而GAD基因被诱导表达。Flu提高了子叶和胚根中DAO基因表达量,却降低了胚芽中其表达量。当AG处理时,DAO活力被抑制的同时,GABA富集量也显著下降,继而诱导了GAD基因的表达。