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第一部分circHIPK2调控神经干细胞的分化目标:神经干细胞(neural stem cell,NSC)能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSC分化的神经元可以替代因损伤、衰老和神经退行性疾病而丢失的神经元。环状RNA(circular RNA,circRNA)在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中表达丰富,但circRNA是否参与NSC分化的调控及其机制尚未明确。我们的前期研究表明circHIPK2参与调控神经炎性。因此,本章节旨在探讨circHIPK2对NSC分化的调控作用,并挖掘其分子机制。方法:应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术检测NSC分化过程中circHIPK2的表达;通过应用circHIPK2 si RNA慢病毒转染NSC(NSC transducted with circHIPK2 si RNA,si-circHIPK2-NSC)敲减circHIPK2表达;采用溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brd U)染色检测circHIPK2对NSC增殖的影响;应用Western blot检测NSC分化细胞中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和β-III微管蛋白(beta-III Tubulin,TUJ1)蛋白的表达;免疫荧光染色技术检测NSC分化细胞中GFAP和TUJ1的表达水平。结果:1)在NSC分化过程中,circHIPK2的表达呈时程性降低;2)敲低circHIPK2显著促进NSC向神经元分化,但不影响NSC向星形胶质细胞分化;3)过表达circHIPK2显著抑制NSC向神经元分化,但不影响NSC向星形胶质细胞分化;4)慢病毒不影响NSC的分化。结论:本节研究发现在NSC的分化过程中,circHIPK2的表达逐渐降低。敲低circHIPK2促进NSC向神经元分化,但不影响其向星形胶质细胞分化。研究表明敲低NSC细胞中circHIPK2表达可以促进其向神经元分化。第二部分SPIO标记NSC的体内示踪目标:监测移植细胞的生物分布和命运是干细胞疗法临床应用中需要首先解决的至关重要的问题。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticle,SPIO)可以成功地标记哺乳动物的多种类型细胞。通过核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和近红外荧光成像(near-infrared fluorescence imaging,NIF)双模态来检测移植SPIO标记NSC在体内的运动与分布情况。本节将探讨SPIO标记的si-circHIPK2-NSC在短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO)小鼠体内示踪的真实性和可靠性,为干细胞移植治疗的效果提供理论依据。方法:采用(cell counting kit-8,CCK-8)、普鲁士蓝染色、MRI、电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)和Brd U实验检测SPIO的特性;建立t MCAO模型小鼠后,脑微注射SPIO标记NSC至侧脑室;通过MRI和NIF监测SPIO标记的NSC在脑内的迁移与分布;免疫荧光染色技术检测SPIO标记NSC在体内示踪的真实性。结果:1)NSC对SPIO的摄取具有浓度依赖性;2)高浓度的SPIO比低浓度的SPIO具有更好的磁性;3)在SPIO标记浓度为200μg/m L时,其对NSC的增殖和分化没有显著影响;4)MRI检测显示在慢病毒circCon si RNA转染NSC(NSC transducted with circCon si RNA,si-circCon-NSC)组和si-circHIPK2-NSC组的注射部位和梗死脑侧均发现大量铁信号,表明SPIO标记的NSC能够迁移到梗死脑区;5)NIF结果表明si-circCon-NSC组与si-circHIPK2-NSC组在荧光强度和体内分布上没有显著差异。在注射部位及梗死脑区皮层存在大量的GFP+NSC,注射的NSC从注射部位逐渐迁移到病变组织;6)免疫荧光实验证实SPIO标记的NSC在体内示踪的真实性。结论:本节首先检测SPIO的特性,NSC对SPIO的摄取具有浓度依赖性。200μg/m L的SPIO对NSC的增殖和分化没有显著影响。双模态成像实现了体内的实时示踪,为评估si-circHIPK2-NSC的治疗效果提供可视化依据。第三部分circHIPK2调控NSC对缺血性脑卒中治疗的作用机制目标:缺血性脑卒中可以导致大量神经细胞丢失和神经功能缺陷。干细胞治疗可增强神经可塑性,促进缺血性脑卒中后神经功能修复。前期研究证实circHIPK2可以调控NSC分化,且双模态成像实时监测到t MCAO模型小鼠移植的NSC的体内分布情况。因此,本节将进一步探究移植si-circHIPK2-NSC对缺血性脑卒中的治疗作用,并探究其调控缺血性脑卒中病理进程的分子机制,以期为缺血性脑卒中的治疗提供理论基础。方法:通过MRI检测移植si-circHIPK2-NSC对t MCAO小鼠梗死体积的影响;通过改良神经功能缺损评分、圆筒实验、粘附移除实验等方法评估移植si-circHIPK2-NSC对t MCAO小鼠神经功能的影响;在离体和整体水平上应用免疫荧光染色技术和western blot技术检测synaptophysin、PSD-95和TUJ1的表达;高尔基染色检测t MCAO模型小鼠皮层神经元树突棘密度;RNA测序获得si-circCon-NSC和si-circHIPK2-NSC的m RNA表达谱。结果:1)移植si-circHIPK2-NSC促进脑卒中后的神经功能恢复,但并不影响脑梗死体积;2)与其他器官相比,circHIPK2在大脑中高度表达。不同时间点t MCAO小鼠梗死侧皮层中circHIPK2的表达水平没有显著改变;3)离体水平敲低circHIPK2促进NSC分化神经元以及分化神经元可塑性;4)敲低NSC中circHIPK2促进t MCAO小鼠的神经可塑性;5)circHIPK2通过下游精胺氧化酶(spermine oxidase,Smox)调控NSC的分化。结论:本节研究发现si-circHIPK2-NSC促进t MCAO小鼠神经功能修复。敲低circHIPK2可促进NSC分化神经元增多以及提高t MCAO小鼠的神经可塑性。NSC中敲低circHIPK2可通过下游蛋白Smox调控NSC的分化。为si-circHIPK2-NSC促进卒中后脑损伤修复提供一定的临床前实验基础。