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背景:急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)是一种起源于AML干细胞的以髓细胞失控性增殖为特征的危及生命的恶性克隆性疾病,AML的临床进展和预后与侵袭细胞类型、遗传学改变以及克隆的生物学特性紧密相关。尽管随着化疗方案的不断改进,AML患者的治疗效果已有明显改善,但复发及大剂量化疗的毒副作用仍是影响AML疗效进一步提高的主要障碍。过去已有研究表明,化疗是无法根除白血病干细胞,未被清除的AML干细胞还能继续维持疾病,最终导致患者复发[1]。从白血病干细胞特性研究AML发病机制,开发新的治疗方案,越来越引起研究者的重视。目前认为AML是起源于一群数量稀少的AML干细胞(LSCs),又叫AML起始细胞,它们具有幼稚的表型和自我增殖、更新的能力。在多数情况下,AML干细胞和正常造血干细胞(HSC)一样,不仅有一些共同的表面标记,如CD34+和CD38";而且AML干细胞通常处于静止期,因此对常规化疗药物十分不敏感,且容易对多种化疗药物产生交叉耐药现象[2]。因此AML干细胞已成为了AML治疗的关键靶点。目前认为AML除了急性早幼粒细胞白血病之外,其他各亚型的AML干细胞的细胞表面抗原的类型大多都是一样的,免疫表型主要为CD34+CD38-。以往对AML干细胞的研究主要是通过从AML患者骨髓中分选CD34+CD38-细胞作为AML干祖细胞或AML起始细胞。但这种方法获得的AML干细胞数量非常有限,往往不能满足研究的需要。KGla细胞系来源于男性AML-MO耐药的细胞株,其高表达多药耐药基因和P糖蛋白,对常规白血病化疗药物高度耐药[3]。近年来国内外学者已有不少文献报道从KGla细胞中分选CD34+CD38-细胞作为AML干细胞进行相应的研究。研究针对AML干细胞的靶向治疗药物前提是建立AML干细胞的动物模型。AML干细胞的特点之一是可以植入非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内。NOD/SCID、鼠是SCID小鼠与糖尿病小鼠的杂交产物,它缺乏功能性NK细胞及循环补体,抗原提呈细胞分化及功能不良,并且不发生自身免疫性糖尿病,有利于肿瘤细胞以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD),是比较理想的造血系统恶性肿瘤动物模型。本研究以分选CD34+CD38-KGla细胞及雌性NOD/SCID小鼠为研究对象,建立AML干细胞NOD/SCID小鼠动物模型,为AML干细胞体内实验研究奠定可靠基础。研究目的:探讨用NOD/SCID小鼠和经流式细胞仪分选出的KG1a中CD34+CD38-的AML干细胞亚群建立急性髓系白血病模型的有效方法,研究AML干细胞在NOD/SCID小鼠体内形成AML的生物学特征,为靶向治疗AML干细胞的药物筛选奠定体内试验基础。研究方法:1、应用流式细胞仪分选KG1a细胞中具有AML干细胞特性的CD34+CD38"亚群,并进行AML干细胞特性的鉴定;2、将NOD/SCID小鼠随机分为实验组和对照组,两组小鼠经全身X线照射2Gy,24h后通过尾静脉注射把CD34+CD38-KGla细胞(用台盼蓝拒染法,细胞活性95%,2×106个/只,液体总量0.2ml)移植到实验组小鼠,对照组小鼠通过尾静脉注射等体积PBS作为正常对照;3、观察小鼠的一般情况,比较两组小鼠移植后体重,应用细胞化学染色动态观察小鼠骨髓及外周血细胞形态学改变;4、移植5周后处死小鼠,采用组织病理检查,检测小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及骨髓等的白血病特征;5、应用骨髓染色体检查分析接受人源KGla细胞移植后的雌性发病小鼠染色体核型;6、采用SPSS13.0软件进行统计学分析,多种处理因素作用比较采用析因方差分析;两组间均数的比较使用独立样本t检验方法;多组间均数比较使用单因素方差分析方法进行统计,在方差分析显著的情况下使用LSD方法(方差齐性)进行多重比较;若方差不齐则采用近似F检验(如Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较;计量资料用x±s表示,检验水准为α=0.05,双侧检验。研究结果:1、KG1a细胞经抗人CD34-FITC、CD38-PE双抗标记后,流式细胞术检测结果显示KGla细胞含有CD34+CD38-细胞,CD34+CD38-亚群细胞占KGla细胞比例为(55.48±4.95)%,而经流式分选后的CD34+CD38-细胞纯度达到(93.16±2.7)%。2、接种CD34+CD38-KG1a细胞4周时,实验组小鼠出现萎靡少动、精神不振、食欲下降、弯腰驼背、皮毛起皱、行动迟缓、喜相拥成团、体重不增或下降。接种5周后,实验组小鼠体质量均较对照组小鼠显著下降(P<0.05),外周血及骨髓涂片易见白血病细胞。3、移植后5周,实验组小鼠腹腔内可见局部实体瘤,肝、脾较对照组小鼠增大,肉眼观可见弥漫性肿瘤结节或呈颗粒状外观;组织切片发现白血病细胞在肝、脾、肺、肾及骨髓中浸润,以骨髓和脾脏受侵犯最为显著,应用免疫组化可检测到脾脏、肝脏中的白血病细胞表达人CD45和CD34特异性标记抗原。4、小鼠骨髓细胞中可见人类染色体核型,且发现其含有7q-,8p+,12p+,i(11q)等染色体异常,与接种的分选后的KGla细胞的异常染色体核型相一致,并出现Y染色体。结论:成功建立AML干细胞NOD/SCID小鼠白血病模型,可用于进行针对AML干细胞的新药疗效实验,评价药物的疗效及相关毒副反应的发生情况。