新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是足月新生儿脑损伤的最常见原因,可引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤,从而引起脑瘫、癫痫、智力低下等严重后遗症,给家庭社会带来沉重的负担。尽管近年来围产医学取得了很大的进展,但HIE仍缺乏有效的治疗,其伤残率及病死率仍高达30%。因此,寻求有效的治疗方法是一件迫在眉睫的大事。高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)治疗是目前认为可能有效的治疗方法之一。我们的课题组在以前的整体动物实验中发现,缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)新生大鼠的SVZ和DG部位的神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)明显减少,HBO治疗可促使SVZ和DG的NSCs增殖(余小河,2006)。课题组进一步证实,HBO治疗可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,且这种增殖的NSCs可迁移到脑损伤的部位并分化为成熟的神经元；其机制与Wnt信号途径中Wnt-3蛋白表达的增加及β-catenin蛋白的活化有关(王晓莉,2007)。这些研究结果为HBO治疗HIBD的临床应用提供了有利的理论依据。但我们以前的研究主要是在整体动物水平进行的,细胞水平的研究将更有利于作用和机制的探讨,在这以前我们尚未丌展细胞水平的研究。脑损伤发生后,机体会启动内源性修复机制,减轻损伤程度。当损伤发生时存在于脑内内源性NSCsi可被激活,对损伤的脑组织起到修复作用。我们课题组既往的实验已经证实了HIBD新生大鼠的脑组织匀浆可促进BMSCs分化成为神经元样细胞(谢岷,2007)。因此我们推测,在HIBD后的脑组织会产生某些内源性的抗损伤因子改变了微环境,唤醒那些蛰伏的内源性NSCs,促使其分化为神经细胞。那么经HBO处理后的新生大鼠脑组织是否也会通过产生某些内源性的抗损伤因子、改变脑组织的微环境而起到治疗作用呢?如果能够证明这一点,这将为HBO治疗的机制提供了新线索。NSCs的体外培养花费昂贵,且悬浮培养的NSCs易贴壁分化,给研究带来一定的困难。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)是骨髓中的一群未定向分化的干细胞,来源广泛,取材方便、简单,在特定分化条件下能分化成神经胶质和神经元,故越来越广泛的应用于神经方面的研究。在大量的整体动物实验中已经证实,将BMSCs移植入损伤的大脑,BMSCs可分化为神经细胞,但由于其分化为神经细胞的比例低,限制了其临床应用。如何扩大其分化为神经细胞的比例呢?根据我们以前的实验结果,推测HBO有可能起到促使BMSCs I句神经元分化的作用。但结果究竟如何,迄今国内外尚未见报道。近年研究发现,胚胎期NSCs的发育与BMP. Wnt等信号系统有密切联系。我们在整体动物上已发现Wnt信号转导通路与HBO诱导内源性NSCs增殖和分化成为神经细胞密切相关。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)不仅参与了神经系统的发育过程,而且在决定NSCs分化方向中发挥了重要的调控作用。这两条信号通路是否在HBO治疗后的NSCs分化进程中起作用,尚未见报道。因此,本课题拟在细胞水平研究HBO诱导BMSCs;分化为神经细胞；HBO诱导NSCs分化为神经细胞；HBO对脑组织微环境的影响；HBO治疗的分子机制等内容,为同种自体干细胞移植治疗脑损伤提供理论依据。小课题研究分为以下三部分：一、高压氧对骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的影响目的：HBO对离体BMSCs分化的影响及相关机制的初步研究。方法：取传至第3-5代BMSCs,加入含1 Ong/mlbFGF、20ng/mlEGF和2%B27的DMEM/F12(1:1)培养基诱导24小时。将诱导后的BMSCs分为对照组(CON,不作HBO处理)和HBO处理组(HBO,压力为2ATA,稳压60min,处理1次)。HBO后继续培养24h,2组细胞在同一时间行免疫荧光染色,分别进行NSE、GFAP、04染色,显微镜下计数BMSCs分化为NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞和04阳性细胞的百分率。同时用Western-blot检测2组细胞Wnt3蛋白的表达。结果：BMSCs用神经干细胞的经典培养基诱导后Nestin表达明显增加。免疫荧光发现,HBO组的NSE阳性细胞和04阳性细胞的分化率与CON组比较明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.0 1)；但GFAP阳性细胞的分化率2组之间无统计学差异(P>0.05)；Western-blot检测Wnt3的表达,发现HBO组Wnt3的表达明显比CON组增多,具有统计学意义,P<0.05。结论：HBO可以促进BMSCs向神经元细胞和少突胶质细胞分化,其机制可能与Wnt3蛋白的活化有关。二、高压氧和脑组织匀浆对NSCs分化的影响目的：本研究旨在探讨HBO和脑组织微环境改变对离体NSCs分化的影响。方法：取出生3日内新生Sprague-Dawley大鼠的脑皮质组织,在含B27,bFGF和EGF的DMEM/F12培养基中悬浮培养NSCs,传代后行Nestin, NSE, GFAP免疫荧光染色,进行鉴定。第一步,找出HBO作用的最佳压力和时间。将传至2-3代的NSCs分为7组：对照组(CON,不作HBO处理)；HBO组根据不同的压力(1ATA,2ATA,3ATA)和时间(30 min,60 min)分为6组(n=6),即1ATA-30min, 2ATA-30min,3ATA-30min, 1ATA-60min,2ATA-60min,3ATA-60min。第二步,采用上述实验获得的最佳作用的压力和时间(2 ATA,60min),观察HBO和微环境改变对NSCs分化的影响,研究分为5组(n=6)：①对照组(CON),不作HBO及脑组织匀浆处理；②高压氧处理组(HBO), NSCs给予HBO (2 ATA,60 min)处理；③正常脑组织匀浆组(NBH), NSCs与正常脑组织匀浆上清液共培养；④缺氧缺血性损伤脑组织匀浆组(HIBH), NSCs与HIBD上清液共培养；⑤HIBH+HBO组：NSCs与HIBD上清液共培养1h后行HBO (2ATA,60min)处理。HBO后继续培养24h,各组细胞在同一时间行免疫荧光染色,分别进行NSE、GFAP、04染色,荧光显微镜下计数NSCs分化为NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞和O4阳性细胞的百分率结果：NSCs分化为NSE阳性细胞的分化率从低到高依次为CON组,1 ATA-30 min组,1 ATA-60 min组,3 ATA-30 min组,2 ATA-30 min组,3 ATA-60 min组,2 ATA-60 min组；除1ATA-30min组与CON组之间无统计学差异(P>0.05),其余各HBO组与对照组之间的差异、同一压力下60min组与30 min组之间的差异及2 ATA-60 min组与其他各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。CON组、HBO组、NBH组、HIBH组、HIBH+HBO组NSCs分化为NSE阳性细胞和O4阳性细胞的百分率依次增加,且差异有统计学意义(P<0.01)。与CON组或HBO组比较,NBH组、HIBH组、HIBH+HBO组NSCs分化为GFAP阳性细胞的百分率减少(P<0.01)。结论：HBO能够促使离体NSCs分化为神经元,条件为2ATA,60min稳压时作用最强。HBO、正常和HIBD新生大鼠的脑组织匀浆均能促进离体NSCs向神经元和少突胶质细胞分化,尤其对神经元的分化作用以HBO+HIBD脑匀浆为最强,其次为HIBD脑匀浆。提示HBO能够增强HIBD脑匀浆中促分化因子的作用。正常和HIBD新生大鼠的脑组织匀浆能抑制离体NSCs向星形胶质细胞分化。三、高压氧影响NSCs分化的机制研究目的：近年研究发现,胚胎期神经干细胞的发育不但与Wnt信号系统有密切联系,BMP信号转导通路也发挥着重要的作用。本部分实验拟检测Wnt信号转导通路和BMP信号转导通路的关键蛋白,探讨HBO影响NSCs分化的分子机制,为HBO能更好的应用于临床提供理论依据。方法：将传至2-3代的NSCs分为5组(n=3),即CON、HBO、NBH、HIBH和HIBH+HBO(具体处理同第二部分),收集细胞,提取总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白,分别检测Wnt3蛋白、β-catenin蛋白、BMP2蛋白的活性；再将NSCs分为2组：①HBO组：NSCs给予HBO处理；②sFRP2/3+HBO组：加入sFRP2/3(Wnt蛋白的拮抗剂),使其终浓度为500ng/ml,然后给予HBO处理。HBO后继续培养12h,收集细胞,提取总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白,分别检测Wnt3蛋白、β-catenin蛋白、BMP2蛋白的活性。结果：CON组、HBO组、NBH组、HIBH组、HIBH+HBO组Wnt3蛋白和BMP2蛋白的表达依次增加(P<0.05);β-catenin总蛋白的表达无明显差异(P>0.05),基本一致：β-catenin胞浆蛋白的表达依次减少(P<0.05),而β-catenin核蛋白的表达依次增加(P<0.05)。在加入sFRP2/3后,NSCs向神经元细胞的分化减少(P<0.01),β-catenin的入核和BMP2蛋白的表达也明显比对照组减少(P<0.05)。结论：Wnt—β-catenin—BMP信号通路参与了HBO和HIBD脑匀浆促进NSCs[向神经元和少突胶质细胞的分化。结论：1.HBO可以促进离体BMSCs向神经元和少突胶质细胞分化,其机制可能与Wnt3蛋白的活化有关2.HBO能够促进离体NSCs分化为神经元,条件为2ATA,60min稳压时作用最强。3.HBO、正常和HIBD新生大鼠的脑组织匀浆均能促进离体NSCs向神经元和少突胶质细胞分化,尤其对神经元的分化作用以HBO+HIBD脑匀浆为最强,其次为HIBD脑匀浆。提示HBO能够增强HIBD脑匀浆中促分化因子的作用。4. Wnt-β-catenin-BMP信号通路参与了HBO和HIBD脑匀浆促进NSCs向神经元和少突胶质细胞的分化。