迄今,缺血性心脏病已成为全人类的头号致死元凶。心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤是重要的损伤类型,也是心血管手术和心肌梗死后发病率与致死率的首要原因。现阶段已有很多药物用于防治心肌IR损伤,但大多不良反应大。中药及民族药毒副作用小,值得一提的是,以现代研究手段从药用植物中分离得到的天然活性物质具有高效的优点,还具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的特点。APG（apigenin-7-O-β-D-（-6’’-p-coumaroyl）-glucopyranoside）是从毛茛科铁线莲属（Clematis L.）植物甘青铁线莲（Clematis tangutica）全草中提取分离获得的天然活性物质,且该植物是治疗心血管疾病的中成药益心康泰胶囊的主要成分。以往研究表明APG具有显著的保护缺血性脑损伤的作用,但其作用于心血管系统的机制并不明确,阻碍了其进一步研究开发。蛋白激酶C（protein kinase c,PKC）是具有单一肽链结构而又广泛分布的的丝氨酸/苏氨酸激酶,且是心肌IR损伤过程中多种信号传递的分子之一。PKC可从细胞质转位到线粒体或者通过启动细胞核内的信号,发挥心肌保护作用,其中以PKC的亚型PKC?的作用尤为突出。研究表明,PKC?在心肌缺血预处理和多种药物预处理抗IR损伤过程中发挥重要作用。我们推测APG可能通过激活PKC?通路发挥心肌保护作用。核因子E2 P45相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2,Nrf2）是氧化应激中的关键转录因子,近年来研究发现Nrf2能减轻氧化应激损伤减少心肌细胞死亡。血红素氧和酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）为诱导型酶,有研究表明组织HO-1表达增加可增强其抗氧化能力,减轻脑缺血再灌注损伤。另有报道某些药物发挥脑保护作用与Nrf2/HO-1通路的激活紧密相关。而PKC?通路或Nrf2/HO-1通路是否参与APG的心肌保护作用有待证实。百里醌（thymoquinone,TQ）是从一种广泛生长于中东地区的黑种草（Nigella sativa）的种子中分离出的主要成分。既往研究发现百里醌具有降压、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性,且对肝、肾缺血再灌注有良好的保护作用,但鲜见关于百里醌对心肌保护作用研究的报道。沉默信息转录调控因子1（silent information regulator of transcription 1,SIRT1）能在应激条件下参与细胞凋亡和衰老等生理生化过程。大量研究报道,SIRT1在动脉粥样硬化、心肌肥厚、高血压等心血管疾病中起着重要作用。p53是SIRT1的非组蛋白作用底物,乙酰化的p53可促进氧化应激诱导凋亡,而SIRT1可将乙酰化的p53去乙酰化,从而改变细胞的凋亡过程。p53上调凋亡因子（p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA）是Bcl2家族的唯有BH3域蛋白,是直接结合Bcl-2并定位于线粒体中以诱导细胞色素C释放的p53的转录靶标。PUMA还可作为氧化应激诱导Bax的激活和神经元凋亡的主要调控因子。高表达的p53可以上调凋亡相关分子的表达,并可诱导PUMA的表达发挥促使细胞凋亡作用。百里醌具有抗缺血再灌注损伤的药理作用,另有文献报道丹参可以通过激活SIRT1发挥抗心肌IR损伤的作用,且丹参中主要活性成分二萜醌类和百里醌都属于醌类物质,所以我们推测SIRT1通路可能参与百里醌的抗心肌IR损伤作用。综上,我们提出:APG和百里醌可能对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。本课题将通过建立心肌缺血再灌注模型等一系列方法,阐明APG和百里醌抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。本研究旨在开发APG和百里醌为新的心肌保护药物,为其实现临床转化奠定基础。研究目的1.探讨APG的心肌保护作用,阐明其抗心肌缺血再灌注损伤可能的作用机制。2.探讨百里醌的心肌保护作用,阐明其抗心肌缺血再灌注损伤可能的作用机制。研究方法第一部分:研究PKC?信号通路是否介导APG抗心肌缺血再灌注损伤作用观察受损心肌经不同浓度APG处理后相关指标的变化,探讨APG对缺血再灌注损伤心肌是否有保护作用;此外观察受损心肌经APG处理氧化应激指标、PKC?分子及凋亡分子的变化,探讨APG发挥心肌保护作用是否与PKC?通路相关。随后特异性阻断PKC?通路,观察在受损的心肌细胞和在体心脏经阻断剂和APG共处理后心肌保护作用的变化,明确PKC?通路的激活是否与APG发挥心肌保护作用的过程有关。1.观察大鼠H9C2心肌细胞经APG处理后增殖的变化,IR心肌细胞损伤后经APG处理细胞凋亡及PKC?分子表达的变化。实验分为4组:（1）Control;（2）IR;（3）IR+APG2μmol/L;（4）IR+APG 4μmol/L。细胞在含APG的高糖DMEM培养基中孵育24h后进行缺血再灌注（I:45min,R:3h）处理。处理结束后检测细胞OD值、培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量、细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的活力和丙二醛（MDA）的水平。Western blot法检测PKC?、Caspase3、Bax和Bcl2的表达情况。2.观察大鼠乳鼠原代心肌细胞IR损伤后经APG处理细胞凋亡及PKC?分子表达的变化。实验分为5组:（1）Control;（2）IR;（3）IR+APG 2μmol/L;（4）IR+APG 4μmol/L;（5）IR+APG 6μmol/L。细胞在含APG的DMEM/F12培养基中孵育24h后进行缺血再灌注（I:45min,R:3h）处理,处理结束后检测细胞OD值、心肌细胞凋亡率、生化指标。Western blot法检测PKC?及相关蛋白表达。3.观察IR心肌细胞经PKC?siRNA和APG共处理相关指标的变化。实验分为4组:（1）IR;（2）IR+PKC?siRNA;（3）IR+APG;（4）IR+APG+PKC?siRNA。处理结束后检测细胞OD值、心肌细胞凋亡率、生化指标,检测凋亡通路分子（Bax,Bcl2,Cleaved Caspase3）和Nrf2/HO-1通路的变化。4.观察C57BL/6小鼠心肌IR损伤后经APG处理凋亡及PKC?分子表达的变化。实验分为5组:（1）Control;（2）IR;（3）IR+1mg/kg APG;（4）IR+5mg/kg APG;（5）IR+10mg/kg APG。将雄性C57BL/6小鼠用2.5%异氟烷麻醉,心脏通过左胸切口暂时外切,并且通过丝缝线将左前降支冠状动脉结扎30min后,释放滑结,再灌注心肌4h。再灌注前10min,小鼠经腹膜注射APG（1,5或10mg/kg）,持续3天。各组处理结束后评价小鼠心功能,检测线粒体氧化应激指标（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）。Western blot法检测PKC?及相关蛋白表达。5.观察C57BL/6小鼠心肌IR损伤后经APG和ε-V1-2共处理相关指标及凋亡相关分子的变化。实验分为4组:（1）IR;（2）IR+ε-V1-2;（3）IR+APG;（4）IR+APG+ε-V1-2。各组处理结束后评价小鼠心功能,检测线粒体氧化应激指标（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）。Western blot法检测凋亡通路分子（Bax,Bcl2,Cleaved Caspase3）和Nrf2/HO-1通路的变化。第二部分:研究SIRT1信号通路是否介导百里醌发挥心肌保护作用观察受损心肌经不同浓度百里醌处理相关指标的变化,探讨百里醌对缺血再灌注损伤心肌是否有保护作用;此外观察受损心肌经百里醌处理氧化应激指标、SIRT1分子及凋亡相关分子的变化,探讨百里醌发挥心肌保护作用是否与SIRT1信号通路相关。随后特异性阻断SIRT1通路,观察受损的离体心脏和心肌细胞中经阻断剂和百里醌共处理心肌保护作用的变化,明确SIRT1通路的激活是否与百里醌发挥心肌保护作用有关。1.观察SD大鼠正常离体心脏经百里醌灌流后SIRT1表达的变化。实验分为4组:（1）Control;（2）TQ 2.5μmol/L;（3）TQ 5μmol/L;（4）TQ 10μmol/L。正常离体心脏经持续KHB灌流120min后,我们采集血流动力学数据,收集冠脉流出液并检测LDH的释放量,检测心肌梗死面积,Western blot法检测SIRT1分子的变化。2.观察IR离体心脏经百里醌处理后各项指标的变化。离体心脏灌流基线稳定后,实验分为5组:（1）Control;（2）IR;（3）TQ 2.5μmol/L+IR;（4）TQ 5μmol/L+IR;（5）TQ10μmol/L+IR。含TQ的KHB处理离体心脏5min后进行缺血再灌注（I:45min,R:60min）处理。我们采集血流动力学数据,收集冠脉流出液并检测LDH的释放量,检测心肌梗死面积。检测线粒体氧化应激指标（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）,Western blot法检测SIRT1及凋亡蛋白的变化。3.观察SD大鼠心肌IR损伤后经百里醌和sirtinol共处理凋亡及相关分子的变化。离体心脏灌流基线稳定后,实验分为4组:（1）IR;（2）sirtinol+IR;（3）TQ+IR;（4）TQ+sirtinol+IR。含TQ（10μmol/L）或混合sirtinol（3.75μmol/L）的KHB处理离体心脏5min后进行缺血再灌注（I:45min,R:60min）处理,我们采集血流动力学数据,收集冠脉流出液并检测LDH的释放量,检测心肌梗死面积。检测线粒体氧化应激指标变化（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）,Western blot法检测SIRT1及凋亡蛋白的变化。4.观察百里醌对大鼠乳鼠原代心肌细胞IR损伤的影响。实验分为5组:（1）Control;（2）IR;（3）TQ 1μmol/L+IR;（4）TQ 2μmol/L+IR;（5）TQ 4μmol/L+IR。细胞在含百里醌的DMEM/F12培养基中孵育24h后进行缺血再灌注（I:45min,R:3h）处理,处理结束后采集细胞形态图,检测细胞OD值、培养液中LDH释放量、心肌细胞凋亡率。检测生化指标（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）。Western blot法检测SIRT1及相关蛋白的变化。5.观察SIRT1 siRNA阻断SIRT1信号通路对百里醌心肌保护作用的影响。实验分为4组:（1）IR;（2）IR+SIRT1 siRNA;（3）IR+TQ;（4）IR+TQ+SIRT1 siRNA。各组经处理后检测细胞活力,观察线粒体氧化应激指标变化（SOD,H₂O₂,MDA,SDH,COX）。Western blot法检测SIRT1及凋亡通路蛋白的变化。研究结果第一部分:研究PKC?信号通路是否介导APG的抗心肌缺血再灌注损伤作用1.本部分先观察了受损H9C2大鼠心肌细胞和受损原代心肌细胞经APG处理是否有保护作用,在IR损伤过程中经APG处理PKC?通路及凋亡相关分子变化。研究发现受损H9C2大鼠心肌细胞和受损原代心肌细胞经APG（2,4,6μmol/L）处理均有显著的保护作用,我们观察到,与IR组比较,经APG处理细胞形态显著改善、细胞活力显著提高、培养基中LDH释放量显著减少（P<0.01）,且心肌线粒体中SOD活力显著升高,H₂O₂、MDA水平显著降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与IR组比较,APG处理可以显著提高SDH、COX水平,升高IR损伤心肌细胞Bcl2的表达,降低凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase3表达,降低了细胞质PKC?分子的表达,升高线粒体PKC?分子的表达（P<0.01）。同时我们发现特异性阻断PKC?通路后,与APG+IR组比较,PKC?siRNA减弱了APG的心肌保护作用（P<0.01）。2.在体心脏研究得到了一致的结果。研究发现,与IR组比较,APG处理能显著保护受损心肌,表现为改善受损心脏功能,且心肌线粒体中SOD活力显著提高,H₂O₂、MDA水平显著降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与IR组比较,APG可以显著提高SDH、COX水平,升高IR心肌细胞Bcl2的表达,降低凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase3表达,降低了细胞质PKC?分子的表达,升高了线粒体PKC?分子的表达（P<0.01）。同时我们发现特异性阻断PKC?通路后,与APG+IR组比较,ε-V1-2处理减弱了APG的心肌保护作用（P<0.01）。第二部分:研究SIRT1信号通路是否介导百里醌的抗心肌缺血再灌注损伤作用1.本部分首先探讨了百里醌对离体心脏的影响。我们发现百里醌（2.5,5,10μmol/L）对受损离体心脏发挥了显著的保护作用,与IR组比较,百里醌降低了心肌梗死面积,改善血流动力学指标,降低LDH的释放量（P<0.01）,且心肌线粒体中SOD活力显著提高,H₂O₂、MDA水平显著降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与IR组比较,经百里醌处理受损心肌SDH、COX水平显著升高,SIRT1和Bcl2的表达显著升高,凋亡蛋白Bax、Caspase3表达显著降低（P<0.01）。同时我们发现特异性阻断SIRT1通路后,与TQ+IR组比较,sirtinol处理减弱了百里醌的心肌保护作用（P<0.01）。2.在心肌细胞研究中我们得到了一致的结论。与IR组比较,百里醌处理能改善受损心肌细胞形态,提高受损心肌细胞活力,降低心肌细胞凋亡率（P<0.01）,且心肌线粒体中SOD活力显著升高,H₂O₂、MDA水平显著降低（P<0.01）。Western blot结果显示,与IR组比较,百里醌可以显著提高SDH、COX水平,提高凋亡蛋白Bcl2的表达,降低凋亡相关蛋白Bax、Caspase3表达（P<0.01）。同时我们发现特异性阻断SIRT1通路后,与TQ+IR组比较,SIRT1 siRNA减弱了百里醌的心肌保护作用（P<0.01）。研究结论1.APG具有抗心肌缺血再灌注损伤作用,其通过PKC?分子转位,诱导抗氧化酶HO-1的表达,减轻IR导致的线粒体氧化应激损伤,减少心肌细胞凋亡,从而发挥心肌保护作用。2.百里醌具有抗心肌缺血再灌注损伤作用,其机制是SIRT1通路参与了此生理过程,抑制了PUMA的表达,氧化应激减轻,心肌细胞凋亡减少,达到心肌保护目的。