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miR-23a～27a～24-2基因簇是位于基因间的一个microRNA簇,拥有其独立的启动子,能够转录表达产生3种成熟的microRNA: miR-23a,miR-24-2和miR-27a。LPS、CpG ODN和poly I∶C都能激活腹腔巨噬细胞中的NF-κB信号通路,同时也能够抑制细胞中miR-23a～24-27a基因簇的转录或其成熟体miR-23a, miR-24-2和miR-27a的表达,提示miR-23a, miR24-27a基因簇很可能与NF-κB之间存在着相关性。RAW264.7中过表达miR-23a, miR-24-2或miR-27a后,可促进促炎细胞因子IL-1β,TNF-α和IL-6的表达,表明miR-23a～24-27a基因簇很可能通过其3种成熟体协同调节炎症反应,从而发挥对炎症的调控作用。
NF-κB信号通路的活化,能够促进p65和STAT3向细胞核的转移,从而促进p65和STAT3对其下游基因的转录调控。本项研究采用生物信息软件,对miR-23a～27a～24-2基因簇启动子上可能结合的转录因子进行预测,发现有与NF-κB信号通路相关的p65和STATx结合位点。将miR-23a～27a～24-2基因簇启动子构建到pGL3-basic荧光素酶报告载体后,与p65 siRNA或STAT3 siRNA共转染HEK293T细胞,通过双荧光报告系统分析,发现抑制p65后,荧光素酶表达降低,而抑制STAT3后,荧光素酶表达显著增加,提示炎症反应活化的p65与STAT3与miR-23a～27a～24-2基因簇启动子间存在着密切的调控关系。
无论是经LPS刺激不同时间的RAW264.7细胞或者是经体内注射LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞,miR-23a的表达均下降,提示LPS在体内外都能够抑制miR-23a的表达。将小鼠腹腔巨噬细胞转染miR-23a mimics,从而过表达miR-23a后,在LPS刺激条件下,促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达明显高于对照组,IL-1β的表达变化不显著;而当细胞转染miR-23a inhibitor,从而抑制内源性miR-23a的表达时,在LPS刺激条件下,IL-6和IL-1β的表达则明显下调,TNF-α的表达变化不显著。由此可以看出,miR-23a与促炎细胞因子的表达之间存在协同性。
由于microRNA通过其对基因的靶向抑制作用而发挥其生物学功能,因此推测miR-23a很可能通过靶向NF-κB信号通路抑制基因发挥作用。为了验证这一假说,构建了携带NF-κB启动子区(NFκBαSR)和荧光素酶报告基因的表达质粒(pGL3-p65promoter),与miR-23a共转染HEK293T细胞,通过双荧光系统检测荧光素酶的表达水平,发现NF-κ B驱动的荧光酶表达上调,进一步证明miR-23a能促进p65的表达,即激活NF-κB的信号通路。进一步采用targetscan等生物信息软件分析,发现NF-κB信号通路抑制基因A203UTR具有miR-23a潜在的结合位点。将其3UTR及其突变体构建到pMIR-report载体后,与miR-23a共转染,检测荧光酶活性,发现A203,UTR使荧光酶活性下调了近2倍,而突变体对照基本没变化;Western blot进一步证实了miR-23a对A20的靶向抑制作用。
已有许多文献报告,LPS刺激巨噬细胞,能够促进A20等抑炎基因的表达,从而形成NF-κB信号通路的负反馈调节通路。因此,miR-23a很可能通过对A20的抑制作用,实现对NF-κB信号通路激活的调控作用,促进IL-6等促炎细胞因子的表达,防止NF-κB信号通路的过度活化。本项研究在microRNA的水平上进一步解释了NF-κB信号通路负反馈调节机理,为自身免疫疾病以及炎症的防治疗提供了新的思路。