目的:以三叶青块根为研究对象,考察3种不同提取方式所得产物及其萃取部位的抗病毒谱、种类和抑毒效果,在此基础上利用超高液相-静电场轨道阱质谱联用(UPLC-Q-Exactive/MS)和质量亏损过滤技术(MDF)对其物质基础进行多角度表征,同时系统分离鉴定三叶青抗病毒药效物质,探明最具开发价值的抗病毒部位(组分),追踪其体外抗Ebola假病毒活性部位(成分),最后复制甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠模型验证其体内药效并探讨作用机制,为全面发现三叶青抗病毒药效物质提供新的技术策略和可靠实验数据,为深入阐明其药效作用机制提供参考,为系统开发三叶青产品提供思路。方法:(1)采用文献法对三叶青的历史沿革、植物基原、自然资源分布状态及现代药学研究等进行考证综述,查阅古今文献近150份,其中,著作60余部,论文80余篇,为三叶青历史发展脉络梳理、药效物质基础表征、作用机制研究和临床开发应用提供文献资料支持。(2)利用传统的实验室水提、70%乙醇回流提取、70%乙醇常温冷浸3种方式提取三叶青块根有效成分,并分别利用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取;对各萃取部位,采用致细胞病变效应法(CPE法),利用流感病毒甲型(H1N1)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒B3、B5型(COX-B3、COX-B5)及呼吸道合胞病毒(RSV)等进行体外病毒谱的筛选,逐日观测细胞病变,计算抑毒指数(TI)。(3)采用阳离子脂质体法转染、包装HIV/Ebola、HIV/Lassa假病毒,用于筛选三叶青块根乙醇冷浸6个不同萃取部位并追踪相应13个流份和7个化合物的体外抗病毒活性,同时利用荧光素酶活性检测法评价受试物在100μg·m L-1、50μg·m L-1、25μg·m L-1、12.5μg·m L-1时的抗病毒效果。使用Cell Titer-Glo?发光法对细胞活力进行检测,用以评价不同浓度时受试物对细胞的毒性作用。(4)在异氟烷呼吸麻醉状态下,建立甲型H1N1流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠模型,以体重变化、死亡保护率为指标,验证三叶青醇浸物的体内抗病毒效果,药物浓度设定为200mg·kg-1、100 mg·kg-1、50 mg·kg-1。模型建立后,逐日观测和记录小鼠体重和死亡情况至第14天,小鼠体重减轻20%以上即视为死亡,按Reed-Muench方法计算半数致死剂量(LD50)。(5)选用甲型H1N1流感病毒制备的肺炎小鼠模型为研究对象,考察三叶青醇浸物对模型小鼠肺指数、肺指数抑制率的影响,进一步通过MTT、ELISA、实时荧光定量PCR等技术方法,考察药物对模型小鼠脾脏T细胞增殖能力及NK杀伤细胞活性、血清中IL-2/IFN-γ/TNF-α等炎症因子浓度、肺组织中IL-2/IFN-γ/TNF-α等因子的m RNA表达等指标的影响,从组织、细胞、分子、基因等不同层面展开深入研究,探讨三叶青体内抗病毒药效作用机制。(6)采用经典提取分离方法,对三叶青块根70%乙醇室温冷浸提取物进行分离,采用大孔树脂凝胶柱层析色谱、硅胶柱层析色谱、葡聚糖凝胶柱层析色谱(Sephadex LH-20)及正(反)相柱色谱、制备高效液相色谱等方法对各萃取部位和流份进行分离纯化,利用核磁共振波谱技术对所得化合物进行结构鉴定。采用UPLC-Q-Exactive LC/MS采集-质量亏损过滤MDF-OTCML数据库检索的分析策略,对三叶青化学成分特别是黄酮类成分进行全面的特异性鉴定。MDF分析的主要参数设置为:正离子模式下,黄酮苷元以5,7,4’-三羟基黄酮为模板,质量范围为271-391amu,质量亏损范围为28-93 mmu;黄酮苷以5,7,4’-三羟基黄酮加单取代六碳糖为模板,质量范围为432-770 amu,质量亏损范围为79-180mmu。负离子模式下,黄酮苷元以5,7,4’-三羟基黄酮为模板,质量范围为269-389amu,质量亏损范围为28-93 mmu;黄酮苷以5,7,4’-三羟基黄酮加单取代六碳糖为模板,质量范围为430-768 amu,质量亏损范围为79-180mmu。结果:(1)本草学文献研究发现,三叶青最早收载于清代植物学专家吴其濬的《植物名实图考》,《中国药典》至今未收录该药。近代学者鲜有对其进行系统考证,其异名、别名繁多,故同物异名、同名异物现象频现。综述文献,确认其植物基原为:葡萄科崖爬藤属崖爬藤亚属圆脐组植物三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.;首次归纳其自然资源分布状况为:我国长江以南所有省份及长江流经的大部分省份(地区)均有自然分布、但长江以北少见或未见;首次系统分析其同物异名、同名异物的成因。(2)药效物质提取实验数据表明,三叶青块根3种方式提取物的乙酸乙酯部位得率:醇冷浸>醇提>>水提,正丁醇部位得率:水提>醇冷浸>醇提。以抑毒指数TI>16的部位计数,病毒被抑制的综合结果为:H1N1>EV71>HSV-1>COX-B3>RSV>COX-B5;在抗H1N1实验中,醇冷浸母液、乙酸乙酯、正丁醇、水4个部位以及醇提母液、乙酸乙酯、正丁醇3个部位抑毒效果最好;在抗HSV-1和EV71实验中,醇提正丁醇、水、母液及醇冷浸水部位有较强抑制作用,而水提正丁醇、水部位抑制作用稍弱;同时,醇冷浸乙酸乙酯、正丁醇、水部位对HSV-1、COX-B3、COX-B5也有一定抑制作用。(3)体外抗假病毒实验结果显示,对于Ebola病毒,三叶青块根醇浸物1#萃取部位在4个浓度均无显著抑制作用,2#萃取部位仅在100μg·m L-1和50μg·m L-1时表现一定的抑制作用;而3#4#5#6#部位在12.5μg·m L-1时,抑制率均在70%以上,随着浓度升高,抑制率也增加,表明呈现剂量依赖性。对于Lassa病毒,6个部位在4个浓度均无明显抑制作用。受试物毒性实验结果表明,3#4#5#6#部位在最高浓度100μg·m L-1时CC50均>100μg·m L-1,表明无细胞毒性。进一步实验表明,3#部位的流份E7和4#部位的流份N1,N2对Ebola假病毒的抑制效果最好,但由此3个流份分离所得7个化合物的抑毒效果不明显。(4)体内药效学实验数据显示,三叶青块根醇浸物大、中、小3个剂量组(200mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1)干预模型小鼠的体重在前8天均呈逐日下降趋势,第8天后逐渐增重,且小剂量组体重恢复最接近空白组,模型对照组到第8天死亡80%;从死亡率保护角度看,3个剂量组模型小鼠存活率均大于80%,模型组存活率仅为20%;大剂量、中剂量组能显著降低模型小鼠肺指数并提高肺指数抑制率。实验结果同时表现出一定的时效关系。(5)体内药效作用机制研究结果表明,三叶青块根醇浸物大、中剂量(200mg·kg-1、100mg·kg-1)均能增强模型小鼠脾脏T细胞增殖能力及NK杀伤细胞活性,且均有显著性差异;进一步实验数据显示,大剂量、中剂量组能够增加模型小鼠血清中抗炎因子IL-2、IFN-γ的含量并抑制促炎因子TNF-α的增长,且均有显著性差异。同时,能使模型小鼠肺脏3种炎性因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的m RNA表达均随时间延长而增加,且IFN-γ在第3-7天、IL-2在第3-5天均比同期的TNF-αm RNA表达速度快、表达数量多。(6)经典提取分离纯化实验中,通过对三叶青块根醇浸物乙酸乙酯、正丁醇部位进一步分离纯化,得到化合物21个;利用核磁共振波谱仪对其进行结构鉴定,其中包含黄酮类化合物12个,蒽醌类化合物1个,甾体类化合物2个以及酚酸类结构6个;经与文献比对,新西兰牡荆苷(黄酮类)和熊果酸(酚酸类)系首次从三叶青块根醇浸物中分离得到的。现代技术表征三叶青物质基础实验中,未经MDF方法处理时,鉴定出了50个化合物(含黄酮类30个),其中,负离子模式下得到36个(含黄酮类22个)、正离子模式下得到32个(含黄酮类23个),而两种离子模式下均能检测到的有19个成分。经MDF技术处理之后,对三叶青中黄酮类成分进行特征性分析,正离子模式下多鉴定出19个成分,负离子模式下多鉴定出4个成分,最终从三叶青甲醇超声提取液中鉴定出73个化合物,其中黄酮类成分53个。对N1、N2、E7三个活性部位物质基础进行表征,分析推测出22种化学成分,其中N1流份得到8种、N2流份得到7种、E7流份得到11种。结论:(1)病毒谱筛选研究。三叶青块根以70%乙醇常温冷浸方式提取的有效成分得率最多;三叶青提取液具有广谱抗病毒的特点,除了石油醚和二氯甲烷部位抑制作用较弱(TI<8)外,其它所有部位均对H1N1等6种试验病毒有不同程度的抑制作用(TI>12),并且抗病毒综合效果明显呈现H1N1>EV71>HSV-1>COX-B3>RSV>COX-B5(以TI>16的部位计数)的特点;在抗H1N1病毒实验中,醇冷浸母液、乙酸乙酯、正丁醇、水4个部位以及醇提母液、乙酸乙酯、正丁醇3个部位抑毒效果最好。实验同时说明,三叶青抗H1N1的药效物质极有可能分布在中高极性部位。(2)物质基础研究。利用UPLC-Q-Exactive LC/MS采集-质量亏损过滤-OTCML数据库检索的鉴定策略,对三叶青块根物质基础进行表征过程中,建立了一种相对全面、快速、高效的化学成分鉴定方法,能够快速鉴定出以黄酮类化合物为主的共73个化学成分,与其它尚未探明的成分共同构成了三叶青块根的药效物质基础。(3)体外抗Ebola假病毒研究。通过三叶青块根醇浸物6个部位体外抗Ebola假病毒实验发现,4个萃取部位的抑毒效果呈现正丁醇部位>乙酸乙酯部位>水部位>母液的特点,且各个部位在最高浓度(100μg·m L-1)时CC50均>100μg·m L-1,说明其对正常细胞无毒性;进一步研究发现,正丁醇部位的N1、N2流份和乙酸乙酯部位的E7流份在浓度低至12.5μg·m L-1时,对Ebola假病毒的抑制率仍然大于90%,说明其对Ebola假病毒的抑制效果最好,但由此3个流份分离所得7个化合物的抑毒效果不明显;根据假病毒颗粒的结构特点,可以推测三叶青药效物质是通过阻断Ebola假病毒入侵正常细胞而发挥抗病毒作用的,作用机制可能是阻断病毒外膜外表面的血凝素糖蛋白突起(haemagglutinin,HA)与宿主细胞结合,同时使另一种神经氨酸酶糖蛋白突起(neuraminidase,NA)无法继续扩散和繁殖从而不能释放出新产生的病毒颗粒,共同确保了活性物质的抑毒效果,对宿主细胞发挥保护作用。(4)体内药效研究。体内药效实验研究表明,三叶青块根醇浸物大、中剂量(200mg·kg-1、100mg·kg-1)能够提高甲型H1N1流感病毒感染小鼠存活率,促进模型小鼠体重恢复,能降低流感病毒性肺炎模型小鼠的肺指数并提高肺指数抑制率,初步明确了体内抗H1N1病毒的药效作用。(5)药效作用机制研究。三叶青块根醇浸物大、中剂量能够能增强模型小鼠脾脏T细胞增殖能力及NK杀伤细胞活性,提高小鼠的细胞免疫功能,减少外源性病毒对机体细胞的损伤;进一步实验表明,大、中剂量能够显著增加模型小鼠血清中抗炎因子IL-2、IFN-γ的含量并抑制促炎因子TNF-α的增长,肯定了其在机体发生炎症反应过程中的作用;深入研究发现,药物能使模型小鼠肺脏3种炎性因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的m RNA表达均随时间延长而增加,IFN-γ在第3-7天、IL-2在第3-5天均比同期TNF-α的m RNA表达速度快、表达数量多,说明这些DNA确实发生了转录从而释放出不同数量的m RNA,此过程亦是炎性因子发挥生理活性的过程,也说明了三叶青块根醇浸物药效作用发生在机体炎性细胞因子形成之前或炎性反应过程当中,且具有不同程度的双向调节和剂量依赖的特点。作用机制可能与其上调血清和肺组织中的抗炎因子IFN-γ、IL-2的浓度,抑制血清和肺组织中的促炎因子TNF-α浓度上调有关。