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L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase,EC 3.5.1.1,L-ASNase）是一种水解酶,能够将L-天冬酰胺脱去氨基生成L-天冬氨酸和氨。该酶具有抗肿瘤活性,在食品和医药等领域应用十分广泛。本研究以一株能够分泌L-ASNase的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/ASNΔ25/B2为生产菌株,对重组L-ASNase发酵、提取和稳定化进行研究。主要研究结果如下:（1）摇瓶发酵优化提高重组L-ASNase产量采用单因素实验考察了培养条件对菌体生长和产酶的影响,初始pH影响较大,最适初始pH为7.5。然后使用神经网络算法对其发酵培养基进行优化。首先通过单因素实验和Plackett-Burman实验筛选显著因素,再进行中心组合实验建立实验数据样本,最后利用JMP10.0建立神经网络模型优化发酵培养基组成。经优化,获得最佳培养基组成如下:蔗糖65 g·L-1、酵母蛋白胨28 g·L-1、玉米浆11 g·L-1、KH2PO4 11.5 g·L-1、NaCl 3.3 g·L-1、硫酸铵4g·L-1、K2HPO4·3H2O 22.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、L-天冬酰胺2 g·L-1。在该培养基条件下,L-ASNase产量达到515.6 U·m L-1,较优化前提高了90.9%。（2）搅拌转速对重组L-ASNase在3 L罐中发酵的影响研究结果表明,搅拌转速不同会导致发酵过程中溶氧水平差异很大,从而导致菌体生长和酶产量差异较大。基于搅拌转速对菌体比生长速率和比产酶速率的影响,建立了两阶段控制搅拌转速策略,即08 h将搅拌转速控制在700 r·min-1,8 h之后将搅拌转速控制在900r·min-1。在两阶段控制搅拌转速条件下,溶氧水平能维持在30%以上,可以满足菌体对溶氧的需求。发酵周期由40 h缩短到36 h,L-ASNase酶活也进一步提高,达到850.6 U·mL-1。（3）补料条件对重组L-ASNase在3 L罐中发酵的影响在优化搅拌转速的基础上对补料分批发酵条件进行研究,分别考察了补料时间、补料培养基组成、补料量以及流加方式对菌体生长和产酶的影响,建立了3 L发酵罐补料分批发酵工艺如下:发酵1628 h恒速流加(18.75 mL·h-1)蔗糖(800 g·L-1),恒速流加(32 mL·h-1)酵母蛋白胨(200 g·L-1)和玉米浆(80 g·L-1)混合氮源。在该条件下,L-ASNase酶活在48 h可达到1413.6 U·m L-1,生产强度达到29.45 U·mL-1·h-1,较分批发酵分别提高了66.2%、24.6%。（4）重组L-ASNase的提取与稳定化研究通过对絮凝剂种类、发酵液pH值、絮凝剂添加量的优化,在发酵液pH为8.0的条件下,添加2%(m·v-1)的氯化钙,絮凝过滤过程的酶活回收率达91.2%。添加终体积分数为40%无水乙醇,乙醇沉淀过程的酶活回收率可达97.9%。添加5%(m·v-1)蔗糖或10%(m·v-1)糊精,冷冻干燥过程的酶活回收率可分别达到98.7%、98.6%,冻干后的酶粉常温储存60天后,酶活保留率分别为95.7%、98.1%。通过单因素实验和正交试验的研究,添加复合保护剂（6%葡萄糖、6%山梨醇、1%大豆蛋白、0.5%柠檬酸钾）到液体L-ASNase中,在65℃条件下保温2 h后酶活保留率达到96.6%,是未添加保护剂的1.5倍。添加复合保护剂的液体L-ASNase常温储存80天后酶活保留率达81.7%,是未添加保护剂的2.8倍。