研究背景2型糖尿病(T2DM)是一种慢性炎性疾病,其发病机制核心为胰岛素抵抗和渐进性胰岛β细胞功能衰退,同时还涉及免疫失衡和胰岛α细胞功能亢进等其他病理生理过程。而干细胞因其可分泌多种生长、调节因子并具有多向分化潜能的特性,促使多项临床及基础研究在干细胞输注治疗糖尿病领域进行了有益的探索。选取何种干细胞、以达到最优的治疗效果,一直是研究者们最为关注的问题。骨髓造血干细胞或骨髓单核细胞输注已被多项研究证实对T1DM和T2DM疗效确切,可降低血糖并改善胰岛功能;但虽然其效果明显,也具有不可避免的缺点:骨髓干细胞的获取为有创性操作,且患者自体骨髓造血干细胞的增殖、分泌能力会因长期处于高糖环境而受损;但若采用异体骨髓干细胞输注,则又面临着免疫抑制剂的使用及药物副作用等问题。因此,越来越多的研究者们也将目光投向除骨髓造血干细胞外的其他种类干细胞,如免疫原性更低的骨髓间充质干细胞、来源更广的脂肪间充质干细胞及无创性获得的脐带间充质干细胞及脐血单个核细胞等。现有的临床研究显示,以上几种干细胞均可起到一定的平稳血糖的作用,但在改善胰岛功能方面不同研究之间尚存在一定的不一致性,尤其在改善胰岛功能方面。目前为止尚未有研究在同一试验标准下比较不同干细胞对血糖控制及胰岛功能的改善作用。考虑到既往单一干细胞输注的临床研究结果的不一致性,为了达到为不同患者制定符合其病情的精准治疗方案、筛选最优的干细胞种类,因此在同一研究标准下比较不同干细胞输注的有效性及各自疗效侧重就有很大临床意义。胰岛是一种高度血管化的组织,其体积占胰腺总体积的1-2%,但血流量却占胰腺总血流的10-20%。鉴于此结构的特殊性,胰岛可迅速感知血糖及激素变化,但也使其极易遭受氧化应激等有害刺激的损伤。一旦胰岛微循环内皮的完整性及功能受损,将导致淋巴细胞的粘附、浸润增加,从而加剧胰岛的破坏:因此,保护胰岛微循环与保护胰岛β细胞功能一样重要。间充质干细胞(MSC)已在多项临床研究及动物试验中被证实能够改善糖耐量和胰岛功能,但其具体是通过分泌何种因子、激活哪条通路达到的以上疗效,仍少有研究报道。Wnt蛋白是一类与生长发育、细胞增殖迁移与干细胞干性维持及分化调节有关的重要因子,一般由干细胞及肿瘤细胞等分化程度较低的细胞分泌,正常状态下的成熟细胞仅表达少量的Wnt蛋白,但在组织损伤修复的过程中可一定程度上调。以细胞种类不同及作用浓度不同,Wnt蛋白可激活不同的下游通路,即的β-catenin依赖性的经典Wnt通路,和β-catenin非依赖性的非经典Wnt通路。既往的研究已证实Wnt通路的激活可促进病理/生理性的血管增生,并且在胰岛β细胞中敲除β-catenin或其下游的TCF7L2均可导致胰岛功能和形态学的异常,进而导致糖耐量受损。Wnt3a、Wnt4均可通过激活经典β-catenin依赖性Wnt通路促进β细胞增殖,而Wnt4对β细胞分泌却没有明显影响。基于以上研究结果,我们合理假设MSC可以通过分泌Wnt蛋白、激活胰岛β细胞及胰岛微循环内皮细胞中的β-catenin通路,改善胰岛功能和微循环内皮功能。研究目的本研究旨在通过评估大鼠骨髓间充质干细胞(bmMSC)、人脐带间充质干细胞(hucMSC)及脐带血单核细胞(CBSC)单次或双次输注的治疗效果,比较每种治疗方案对糖尿病鼠血糖状况、胰岛功能、胰岛素抵抗和慢性炎症反应的影响,以期探讨各种干细胞的治疗侧重,为临床应用的干细胞选择提供最优方案,为干细胞个体治疗方案的拟定提供依据。继而我们通过bmMSC体外与胰岛微循环内皮细胞MS-1及离体胰岛的共培养,探讨了 MSC分泌的Wnt蛋白和胰岛内β-catenin依赖的Wnt通路对氧化应激损伤下的MS-1和胰岛功能的作用。研究方法第一部分不同种类干细胞静脉输注对2型糖尿病大鼠治疗效果的比较1、通过高脂高糖饮食+小剂量STZ诱导2型糖尿病SD大鼠模型,每周监测血糖,确定造模成功。于造模成功后7天,对T2DM大鼠进行随机分组:T2DM、T2DM+bmMSC、T2DM+hucMSC、T2DM+CBSC。对于T2DM+hucMSC的部分大鼠,于首次输注干细胞后2周进行第二次干细胞治疗,输注HucMSC或CBSC。于第一次干细胞注射后2w、4w、8w分别进行IPGTT并尾尖取血测血糖、胰岛素、胰高糖素,三天后处死,留取空腹血及各类脏器。2、比较不同处理组的血糖控制情况:每周检测1次鼠尾血糖。IPGTT采用腹腔注射葡萄糖1.5g/kg体重,大鼠用异氟烷麻醉,剪尾取血。3、比较不同处理组的胰岛功能及形态学变化:放免法检测空腹胰岛素/胰高糖素及IPGTT后的胰岛素/胰高糖素曲线变化。胰腺石蜡切片HE染色观察胰岛形态及大小改变。胰腺石蜡免疫组化染色观察胰岛素阳性区域大小及比例改变。胰腺石蜡免疫荧光染色观察胰岛素(+)/胰高糖素(+)区域比例及PCNA、胰岛素双阳性细胞在胰岛素阳性细胞中的比例。4、比较不同处理组的胰岛素抵抗状态改变:HOMA-IR、胰岛素敏感性指数Matsuda index和胰岛素敏感性指数Belfiore index评判大鼠胰岛素抵抗状态。同时肝脏Western blotting检测p-AKT/t-AKT和p-Erk/t-Erk胰岛素通路相关蛋白的表达趋势。5、比较不同处理组肝脏糖代谢的改变:提取肝脏蛋白,Western blotting检测肝糖代谢关键酶糖原合成酶激酶(GSK3)、肝脏糖摄取关键蛋白葡萄糖转运子2(GLUT2)、糖酵解关键酶丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)及糖异生关键酶葡萄糖-6-磷酸异构酶(G-6-Pase)、磷酸烯醇丙酮羧基酶-1(PCK1)的表达量。同时肝脏组织石蜡切片糖原染色,观察糖原储存量的改变。6、比较不同处理组的脂代谢的改变:生化法检测TC、TG、LDL、HDL和FFA。7、比较不同处理组的血清学代谢指标及炎性因子的变化差异:ELISA法检测IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α 及 IFN-γ。第二部分MSC改善胰岛及胰岛微循环内皮细胞功能的机制研究1、通过H2O2刺激构建大鼠离体胰岛及胰岛微循环内皮细胞MS-1的氧化应激损伤,并用Transwell系统将其与bmMSC共培养,检测离体胰岛的活性及GSIS胰岛素分泌,MS-1的活性、凋亡及eNOS活性等功能学指标。2、qPCR比较大鼠离体胰岛及胰岛微循环内皮细胞MS-1与bmMSC的Wnt蛋白表达差异,并观察bmMSC输注后或Transwell培养后胰岛及MS-1中β-catenin依赖性的Wnt通路的激活情况。3、使用XAV-939特异性阻断胰岛或MS-1中的β-catenin,观察bmMSC共培养对H2O2诱导的氧化应激损伤的挽救作用是否被抵消。4、对bmMSC中的Wnt4、Wnt5a分别进行敲除,并将敲除后的bmMSC与胰岛和MS-1分别共培养,观察Wnt4和Wnt5a敲除对胰岛和MS-1氧化应激的活性变化、凋亡及胰岛素分泌量、eNOS活性等功能学指标的改变。5、将分别敲除Wnt4、Wnt5a后的bmMSC与MS-1分别培养,观察MS-1中的β-catenin依赖性的Wnt通路的激活情况。研究结果第一部分不同种类干细胞静脉输注对2型糖尿病大鼠治疗效果的比较1、T2DM造模成功后SD大鼠血糖明显升高,但干细胞输注后空腹血糖较前明显下降,该治疗效果可维持至输注后8w。不同干细胞及不同输注次数的组间,空腹血糖水平无明显差异。IPGTT结果显示干细胞输注后2w大鼠的餐后血糖并无明显改善;然而至4w时各组各时点的血糖均较T2DM有明显下降。8w时,虽然空腹及餐后0.5h干细胞干预组仍可保持较好血糖控制,然而除了 hucMSC+CBSC双次注射组外,其余各组的1-3h血糖均与T2DM组无明显差别。2、干细胞输注可显著抑制T2DM大鼠升高的空腹胰高糖素,各组间效果无明显差异。bmMSC或CBSC单独输注均可显著改善T2DM大鼠的空腹胰岛素水平,其他各组对此指标的改善不明显。胰岛素释放试验结果显示,干细胞输注2w时,bmMSC输注组的餐后胰岛素水平有明显升高,其他组无明显改变,但各组释放曲线形态均较紊乱;至4w时,各组胰岛素释放曲线明显规整,基本均可于餐后3h回落至基线水平,其中bmMSC或CBSC单独输注的餐后胰岛素水平均明显高于T2DM未处理组;8w时,bmMSC输注组的释放曲线进一步趋近正常,而hucMSC+CBSC双次注射组表现出明显的餐后胰岛素释放增多。除bmMSC组外,其他各组均可显著抑制餐后胰高糖素的分泌。3、干细胞输注后2w及4w,干细胞可显著保存胰岛面积;在保存β细胞面积方面,bmMSC的效果较明显。对于改善胰岛内α、β细胞比例方面,干细胞输注后2w各组均未见明显改善;4w时,bmMSC表现出较为明显的β细胞比例增加,而所有干细胞输注组的α细胞面积均显著减少,各组间无明显差异;8w时,所有干细胞输注组的α细胞面积均显著减少的趋势持续,而CBSC单次注射及hucMSC+CBSC、hucMSC*2次三组均表现为β细胞比例明显增加:提示CBSC单次注射或干细胞2次注射可将改善β细胞比例的治疗维持更久。4、在干细胞输注2w及4w时均可于CBSC单次输注、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次输注组中观察到PCNA阳性的β细胞明显增多,提示β细胞增生。而观察至8w,增生的情况明显降低,唯有hucMSC+CBSC仍可观察到明显的增生。5、本研究还观察到CBSC组部分胰岛细胞出现胰岛素与胰高糖素共染的情况,但该现象并未在其他组中出现,提示CBSC可能促进了 α向β细胞的转化。6、经过胰岛素敏感性指数及肝脏胰岛素通路相关蛋白表达的双重印证,bmMSC单次输注、hucMSC单次输注及hucMSC先后两次输注可显著改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗状态。7、空腹的T2DM大鼠肝脏中存在糖原合成减少、糖酵解受抑、糖异生增加及胰岛素抵抗;而干细胞的输注可选择性地作用于其中不同的关键酶,发挥调节作用:在改善肝糖原合成方面,本文涉及的所有干细胞输注方案均有效果;改善葡萄糖转运方面,bmMSC与hucMSC单次输注效果明显;bmMSC与hucMSC单次输注亦可促进糖酵解、抑制糖异生并改善空腹肝脏胰岛素抵抗。输注多次干细胞的两组对肝脏的作用则更多体现在抑制糖异生及改善胰岛素抵抗方面。8、除CBSC单次输注组可观察到明显TC、TG下降外,其他各组对血脂指标的改善不明显。9、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次输注可明显改善各项炎症相关免疫指标,如IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22 及 IFN-g。第二部分MSC改善胰岛及胰岛微循环内皮细胞功能的机制研究1、bmmMSC与MS-1细胞共培养可显著改善H202所致的凋亡、eNOS活性降低及VCAM升高;同时也可改善氧化应激损伤后离体胰岛的活性下降及高糖刺激下的胰岛素分泌障碍。2、bmMSC较离体胰岛和MS-1细胞可表达显著增高的Wnt4和Wnt5a。bmMSC静脉输注的T2DM大鼠胰岛中存在β细胞和内皮细胞的β-catenin核转位,同时与MSC共培养后的MS-1也存在β-catenin核转位增加,提示MSC可激活β细胞及内皮细胞中的经典Wnt通路。3、用XAV-939处理胰岛及MS-1后,bmMSC的上述改善作用显著降低,提示干细胞的有益作用可能由激活经典Wnt通路介导。4、在MSC中分别沉默Wnt4、Wnt5a后再与H202刺激的MS-1/离体胰岛共培养,结果显示Wnt4沉默可显著降低MSC对上两者的改善作用:说明MSC分泌的Wnt4可能是介导其对氧化应激胰岛及内皮细胞挽救作用的关键因子之一。5、在MSC中沉默Wnt4后MS-1细胞中经典Wnt通路激活减弱,提示MSC分泌的Wnt4可通过激活经典Wnt通路,改善胰岛微循环内皮细胞的存活及功能。研究结论在我们的研究中,首次对比了骨髓、脐带来源的间充质干细胞及脐血干细胞,输注一次或两次对T2DM大鼠模型胰岛功能和糖代谢的改善效果,首次观察了干细胞输注对胰岛α细胞功能和比例的影响,并观察了干细胞对IL-22的作用。1、所有干细胞在降低T2DM空腹血糖方面效力等同,但在平稳餐后血糖方面唯有hucMSC+CBSC的治疗组可将有效性持续至输注后8w。2、bmMSC和CBSC组改善空腹胰岛素作用明显,bmMSC和hucMSC+CBSC先后注射组改善糖负荷后胰岛素分泌的作用可持续至8w。3、CBSC单次注射或干细胞2次注射(T2DM+hucMSC&CBSC组及T2DM+hucMSC*2组)可将改善β细胞比例的治疗维持更久,可能与维持持续性的β细胞增生有关。4、各种干细胞输注均可明显抑制胰高糖素空腹及餐后的分泌,并抑制α细胞的增生。5、bmMSC单次输注、hucMSC单次输注及hucMSC先后两次输注均可显著改善胰岛素抵抗状态。6、本文涉及的所有干细胞输注方案均可改善肝糖原合成;bmMSC与hucMSC单次输注可显著改善肝脏葡萄糖转运,亦可促进糖酵解、抑制糖异生;hucMSC双次输注可促进糖酵解、抑制糖异生。7、CBSC单次输注可明显降低TC、TG。8、双次注射干细胞组可明显改善体内炎症状态、降低血清IL-1 β、IL-6、IL-17、IL-22及IFN-γ的水平。9、干细胞输注后的胰岛内分泌部及胰岛微循环内皮细胞均存在不同程度的经典Wnt通路激活。10、bmMSC可通过分泌Wnt4,激活离体胰岛及胰岛微循环内皮细胞中的β-catenin依赖性的经典Wnt通路,改善胰岛功能、减少氧化应激所致的内皮细胞功能紊乱和凋亡。