海参作为我国单品产值较高的水产品,2018年全国年产量超过17.4万吨,产值超过400亿元。海参的加工制品种类多样,其中即食、鲜食海参因可以避免干制、水发等工艺而减少了大量的营养成分流失,且食用方便、口感较好。在评价即食海参品质的众多指标中,嫩度较为重要。海参体壁中70%以上的蛋白为胶原蛋白,且在自然状态下胶原蛋白交联聚集成具有较强机械性能的胶原纤维网络结构,因此其加工制品的嫩度较难把控。低温嫩化技术可提高海参体壁的嫩度,主要依赖内源酶对结构蛋白的降解作用。但在海参体壁低温嫩化过程中,有哪些内源酶参与,这些内源酶又是被如何激活,涉及哪些生物分子信号机制,这些问题尚不清楚。为此,本文围绕解释上述问题展开研究,揭示内源酶参与调控海参嫩化的机理,以及嫩化过程中内源酶激活的分子生物学机制,为海参嫩化加工过程的品质控制提供理论依据。(1)采用质地剖面分析、流变分析、差式扫描量热(DSC)、光镜-组织化学、扫描电镜(SEM)和电子顺磁共振波谱(EPR)技术,对海参体壁低温嫩化过程中的理化特性进行表征。通过测定羰基、巯基和氨基的含量、蛋白分布模式、胶原蛋白溶出情况表征蛋白一级结构的变化,通过测定圆二色性和表面疏水性表征蛋白二级和三级结构的变化。结果表明,随着嫩化时间的延长,海参体壁的硬度、咀嚼性和弹性均显著降低。胶原蛋白的热稳定性降低,微观结构上出现胶原原纤维解聚的现象。水溶性蛋白中,氨基酸侧链修饰、二级三级构象趋向不稳定转变,自由基大量生成,表明蛋白氧化的发生。游离氨基释放、结构蛋白降解,表明蛋白降解的发生。揭示海参体壁嫩化的实质为胶原纤维结构的破坏,伴随蛋白氧化和蛋白降解作用,为后续开展嫩化机理研究奠定基础。(2)采用分光光度法测定海参体壁嫩化过程中内源酶活力的变化,然后正向添加胶原酶和反向添加蛋白酶抑制剂分别处理海参体壁,通过测定TCA可溶性寡肽、羟脯氨酸含量和蛋白分布模式的变化来说明蛋白的降解情况。结果表明,海参体壁嫩化过程中,cathepsin L、caspase-3和MMPs的活力显著提高。胶原酶可对海参体壁进行降解,且与嫩化后海参体壁蛋白的降解模式一致。半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的抑制剂均可不同程度地抑制小分子蛋白的降解,且后两者针对大分子蛋白的降解也有明显抑制作用。从3种不同角度证实了嫩化过程中以半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶为主的内源酶参与了蛋白的降解。(3)以海参胶原纤维为模型,对其分别进行氧化、热处理以及二者共同作用。采用分光光度法、电泳、高效液相色谱等技术研究蛋白和糖胺聚糖的溶出和降解情况。采用EPR、傅里叶变换红外、DSC和SEM表征胶原纤维结构的变化。采用茶多酚(EGCG)对热处理模型进行抗氧化处理,通过上述测试判断热处理过程中是否伴随氧化作用的参与。结果表明,氧化和热处理均可导致蛋白、糖胺聚糖溶出,氧化更容易促进小分子蛋白溶出和蛋白聚糖降解。氧化和热处理均可导致胶原蛋白氧化,促使胶原原纤维的解离,α-螺旋向β-折叠转换,热变性温度降低,肽键断裂的特征分解温度降低。当EGCG添加量为125μg/mL时,可显著抑制热处理造成的蛋白聚糖和胶原蛋白的结构变化,提高胶原纤维的稳定性。揭示了氧化在海参体壁嫩化过程中的重要作用,即热处理可造成大量自由基产生,引发蛋白氧化,直接导致胶原纤维结构的被破坏,宏观表现为嫩度的提高。(4)采用iTRAQ蛋白组学技术研究海参体壁低温嫩化过程中差异蛋白的表达,然后结合生物信息学分析手段对差异表达蛋白进行生物功能和信号通路注释。结果表明,cathespins、calpains、caspases、proteasomes和MMPs的蛋白表达量均显著上调。生物信息分析证明了嫩化过程中主要涉及氧化应激、固有免疫反应、细胞凋亡、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白重组等生物学进程,且彼此间存在交互作用。从蛋白表达水平上揭示了内源酶介导嫩化的分子机制。(5)采用转录组测序(RNA-seq)技术来研究海参体壁低温嫩化过程中差异基因的表达,然后结合生物信息学分析手段对差异表达基因进行生物功能和信号通路注释,再利用RT-qPCR技术通过测定特征mRNA表达量的变化来验证转录组测序的准确性。结果表明,RT-qPCR分析的10个基因表达量的变化幅度与RNA-seq结果的变化幅度相似,验证了RNA-seq结果的可重复性和可靠性。RNA-seq结果中MMP 2和MMP 16的基因表达量均显著上调。生物信息分析证明了嫩化过程中主要包含氧化应激、固有免疫反应、细胞凋亡、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白重组等生物学进程,且彼此间存在交互作用。从基因表达水平上揭示了内源酶介导嫩化的分子机制。综上,海参体壁的低温嫩化是较为复杂的生物学过程,内源酶cathespins、calpains、caspases、proteasomes和MMPs均参与其中,同时涉及氧化应激、固有免疫反应、细胞凋亡、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白重组等生物学进程。其中氧化作用不仅对内源酶等生物信号的激活至关重要,还可直接破坏胶原纤维结构。