研究背景多囊卵巢综合征(ploycystic ovarian syndrome PCOS)是导致排卵障碍的最常见的原因,该病以无排卵、卵巢多囊性改变和高雄激素血症或高雄激素表现为主要特征,临床表现多样。包括月经异常(月经稀发、闭经、功能失调性子宫出血)、不孕、多毛、痤疮、肥胖、多棘皮症等,并常伴胰岛素抵抗、高胰岛素血症及高脂血症；其中9-30%的患者还伴有血清催乳素水平增高。该病还与早期妊娠丢失、妊娠晚期合并症及卵巢癌等泌尿生殖系恶性肿瘤的发病等有一定的关联。目前对于该病的发病机制及诊断尚存在不少争议。目前西医治疗PCOS的主要的手段有：饮食控制、药物治疗及手术治疗。但有部分患者在规范的西医治疗后仍未能获得满意的临床结局。中医中药从“肾、肝”等论治取得不错的临床疗效。只是目前关于中药促排卵大多数依旧是经验用药,缺乏实验依据,临床应用时可重复性差等不足；邢福祺教授先前的基础实验提示一些药物如仙茅、巴戟天、肉苁蓉、菟丝子、淫羊藿、熟地黄、枸杞子等七味补肾中药显著性增加大鼠垂体细胞分泌FSH的量,芍药、甘草、仙茅、巴戟天等四味中药能显著降低大鼠垂体前叶细胞催乳素的分泌量。本研究依据先前的实验依据,并依据中医从“肾、肝”论治排卵障碍的理论,选取仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等六味药合用,探讨上述六味药物对排卵障碍小鼠的促排卵作用和机制。并观察上述药物在多囊卵巢综合征患者中的临床疗效。第一章几种补肾调肝中药促卵泡发育机制的实验研究目的利用排卵障碍模型小鼠,观察仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等六味补肾调肝中药对子宫及卵泡发育的影响,并初步探讨上述中药可能的促卵泡发育机制。方法1.无排卵小鼠模型的建立与分组：选择5日龄雌性昆明小鼠120只,随机选择100只于颈背部皮下注射丙酸睾丸酮0.04ml(1ml:25mg),其余20只小鼠相同部位皮下注射等量中性茶油0.04mL作为对照(F组)。将注射过丙酸睾丸酮的小鼠随机分为5组,A组为低剂量中药处理组,B组为中等剂量中药处理组,C组为高剂量中药处理组,D组为克罗米芬对照组,E组为模型组；A、B、C、D、E组小鼠自8周龄大小时开始每日取阴道脱落细胞涂片镜下观察,连续十日,涂片出现持续性角化细胞提示造模成功。2.给药方法：造模成功后开始每日灌胃,A组小鼠每日0.5g/ml中药0.5ml灌胃,连续10天,B组小鼠每日1g/ml中药0.5ml灌胃,连续10天,C组小鼠每日2g/ml中药0.5ml灌胃,连续10天,D组小鼠每日1.2mg/ml枸橼酸克罗米芬0.5ml灌胃,连续10天,E、F组每日蒸馏水0.5ml灌胃连用10天。3.标本的获取：所有小鼠均与最后1次灌胃后24小时称重,后摘取眼球取动静脉血约1.Oml于促凝采血管中,离心后分离血清,并保存在4℃冰箱中待检测。采血后颈椎脱臼法处死小鼠,常规消毒后逐层剪开小鼠腹壁、腹膜,顺子宫向上找到小鼠卵巢组织,剪下小鼠子宫及卵巢,剔除周围筋膜及脂肪组织,标本称重,称重后经标记迅速投入4%甲醛溶液中固定。同时计算每只小鼠的子宫指数(mg/100g)及卵巢指数(mg/100g)。4.激素的测定及免疫组化检测生长分化因子-9(growth differentiation factor 9 GDF-9)的表达：放射免疫法测定小鼠血清雌二醇及卵泡刺激素浓度,常规防脱石蜡切片,免疫组织化学法(SABC法)测定小鼠卵巢中生长分化因子-9的表达,每组均设一切PBS代替抗作空白对照。并按以下标准对免疫组化结果进行判读：采用盲法阅片。阳性判断标准：每张染色片随机选取5个视野,以背景清晰,细胞质着色呈棕黄色为阳性反应,据阳性颗粒的强度及阳性细胞的比例进行如下判断,并分为(-)、(+)、(++)、(+++)4个等级。5.统计学方法：数据均用统计软件包SPSS19.0分析,计量资料用x±sd表示,计数资料用率表示；计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,对呈正态性分布和方差齐同的数据,进行方差分析；对不呈正态性分布和方差不齐的数据使用基于方差不齐的近似方差分析。两两间的比较采用LSD法(方差齐性)或Dunnett-T3法(方差不齐)检验。计数资料采用行×列表的多个样本的非参数检验检验(Kruskal -Wallis检验)。检验水准取α=0.05,结果以P<0.05为有显著性差异。结果1.各组小鼠间卵巢指数、子宫指数及血清FSH、E2水平等均存在显著性差异。采用LSD法进行两两比较时发现,克罗米芬组与中药组血清FSH显著高于模型组小鼠。各组间血清雌二醇浓度均存在显著性差异,其中克罗米芬组>高剂量中药组>中剂量中药组>低剂量中药组>空白对照组>模型组；子宫指数中剂量中药组与高剂量中药组之间及克罗米芬组与空白对照组之间无显著性差异(P值均为1.000),其他各组间均存在显著性差异(P<0.05),其中中高剂量中药组>低剂量中药组>克罗米芬组与空白对照组>模型组；中剂量中药组、高剂量中药组及克罗米芬组卵巢指数显著低于模型组(P<0.01)。2.模型组可见较多原始卵泡,多呈囊性扩张,生长卵泡数目较少。中药组及克罗米芬组见生长卵泡数目明显增多,发现优势卵泡及成熟黄体,卵泡未见明显的囊性扩张。经多样本非参数检验发现各组卵泡的卵泡构成比有显著性差异(卡方值为22.561,P值0.000)。3.各组间GDF-9免疫组化染色强度有显著性差异(卡方值为48.072,P值为0.000),中药组GDF-9免疫组化染色强度高于模型组。结论1.对5日龄雌性小鼠使用丙酸睾丸酮皮下注射成功造小鼠雄激素所致不孕(排卵障碍)模型2.仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等六味补肾调肝中药对排卵障碍小鼠具有促卵泡发育的作用3.上述六味补肾调肝中药能上调排卵障碍模型小鼠卵母细胞生长分化因子-9表达,这可能是上述补肾调肝中药促卵泡发育的机制之一第二章几种补肾调肝中药用于多囊卵巢综合征患者促排卵的临床研究目的探讨仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等6味补肾调肝中药应用于PCOS患者中促排卵的作用,比较上述补肾调肝中药与枸橼酸克罗米芬及来曲唑等常用促排卵药物临床结局的差异。方法1.研究对象：2008年12月至2010年12月就诊于南方医院生殖医学中心诊断为多囊卵巢综合征(参考2007年日本妇产科学会诊断标准)并要求促排卵指导同房的患者。均经子宫输卵管造影或者腹腔镜检查证实至少一侧输卵管通畅,男方精液密度≥20×106/ml,活动率a+b%≥30%。经排除标准排除后符合入组条件患者111例。2.研究资料分组：所有患者随机(随机表法)分为A、B、C三组,A组为补肾调肝中药治疗组(仙茅20克、巴戟天20克、菟丝子20克、淫羊藿10克、白芍药20克、甘草10克服用时将上颗粒制剂—并倒入100ml热开水后分两次服用),B组为枸橼酸克罗米芬组(100mg×5d),C组为来曲唑治疗组(5mg×5d)。A组患者38例,共完成101个促排卵周期治疗；B组患者37例,共完成102个促排卵周期治疗；C组患者36例,共完成101个促排周期。3.主要观察指标：hCG日血清雌二醇、血清催乳素浓度,hCG日子宫内膜厚度,hCG日成熟卵泡数(卵泡径线≥14mm),排卵率,临床妊娠率,多胎妊娠率及卵巢过度刺激综合征发生率等。4.统计学方法：数据均用统计软件包SPSS19.0分析,计量资料用x±sd表示,计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,对呈正态性分布和方差齐同的数据,进行方差分析；对不呈正态性分布和方差不齐的数据使用基于方差不齐的近似方差分析。两两间的比较采用LSD法(方差齐性)或Dunnett-T3法(方差不齐)检验。计数资料用率(%)表示,采用行×列表的多个样本的非参数检验检验(Kruskal -Wallis检验)。检验水准取α=0.05,结果以P<0.0.5为显著性差异。结果1.基本信息的比较：中药组、枸橼酸克罗米芬组与来曲唑组之间患者年龄、不孕年限、原发不孕比例、体重指数、血清基础性激素(含黄体生成素、卵泡刺激素、睾酮、催乳素、雌二醇)等均无显著性差异；2.hCG日激素水平、成熟卵泡数及子宫内膜厚度等比较：中药组、枸橼酸克罗米芬组及来曲唑血清雌二醇水平分别为：381.1±134.5pg/ml、759.0±506.4pg/ml、560.3±259.9pg/ml；血清催乳素分别为：16.75±9.29pg/ml、24.48±17.72pg/ml、25.22±18.93pg/ml；成熟卵泡数(≥14mm)分别为1.35±0.71、2.77±1.69、1.89±0.91；子宫内膜厚度分别为：10.01±2.19mm、8.69±2.04mm、8.81±2.07mm;进行比较时发现3组患者之间的血清雌二及催乳素水平、成熟卵泡数及子宫内膜厚度有显著性差异,进行两两比较时发现中药组显著低于其他两组,成熟卵泡数中药组显著低于其他两组,子宫内膜的厚度显著高于枸橼酸克罗米芬组与来曲唑组(O值均小于0.001);3.排卵率及临床妊娠率等指标的比较：中药组、枸橼酸克罗米芬组及来曲唑组的累积排卵率分别为67.3%、69.6%、63.4%,卡方值为0.994,P值为0.608,无显著性差异；累积妊娠率分别为：31.6%、35.1%、30.6%,卡方值为0.192,P值为0.908,无显著性差异。每一周期的排卵率及临床妊娠率也无显著性差异；中药组患者无多胎妊娠发生,1名患者B超下证实为异位妊娠,枸橼酸克罗米芬组患者多胎妊娠率为23.1%(3例),其中有7.7%(1例)患者为三胎妊娠,来曲唑组患者多胎妊娠率为18.2%(2例),3组之间无显著性差异(卡方值为0.975,P值为0.614)。结论1.仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等补肾调肝中药用于PCOS促排卵时可以达到促排卵的效果,其周期排卵率,每周期妊娠率及临床妊娠率与枸橼酸克罗米芬及来曲唑等经典促排卵药无显著性差异；2.仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等补肾调肝中药用于PCOS患者促排卵时与枸橼酸克罗米芬及来曲唑等药物相比具有以下优势：单卵泡发育率高、对子宫内膜影响小等；3.考虑到我们使用上述中药促排卵时发现临床妊娠结局并不优于枸橼酸克罗米芬及来曲唑等药物,同时中药使用的安全性等问题需要进一步的研究去证实,我们不推荐常规使用补肾调肝类中药对PCOS患者进行促排卵治疗；4.对反复使用枸橼酸克罗米芬、来曲唑等药物治疗失败者,包括反复子宫内膜过薄、多卵泡发育、药物抵抗无反应或药物副作用无法耐受等患者可以考虑使用被证实有促排卵作用的中药,如：仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等进行促排卵治疗全文小结1.对5日龄雌性幼小鼠皮下注射丙酸睾丸酮成功造雄激素所致不孕(排卵障碍)小鼠模型；2.仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等补肾调肝中药对雄激素所致不孕小鼠具有促卵泡发育的作用；3.上述补肾调肝中药显著增加GDF-9因子在雄激素所致不孕小鼠中的表达,这可能是菟丝子等6味中药促卵泡发育的机制之一；4.仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草用于多囊卵巢综合征患者促排卵其排卵率及临床妊娠率与克罗米芬或来曲唑相似,但hCG日内膜厚度显著高于其他两组,同时中药组能将异常升高PRL患者PRL浓度降至正常；5.由于缺乏对中药使用安全性的研究,也无中药促排卵优于克罗米芬等促排要的证据,我们不推荐使用上述中药作为一线促排卵治疗。但对反复使用枸橼酸克罗米芬、来曲唑等药物治疗失败者,或合并有高泌乳素血症患者,可以考虑使用被证实有促排卵作用的中药,如：仙茅、巴戟天、菟丝子、淫羊藿、白芍药及甘草等进行促排卵治疗。