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镉（Cadmium,Cd）是环境中常见的重金属污染物,人和动物主要通过饮水和食物吸收外界环境中的镉,导致镉在体内蓄积。肝脏作为人体内重要的消化器官,是镉蓄积的主要靶器官之一。大量研究表明,镉可损伤肝脏,引起肝脏氧化应激、炎症、脂肪代谢紊乱等。本实验室前期研究证实,镉暴露对大鼠BRL3A细胞造成毒性损伤,且呈浓度-时间效应关系;同时还会引起细胞自噬水平升高、自噬流阻滞。牛磺酸（Taurine,Tau）是动物体内本身就存在的一种游离氨基酸,具有抗氧化、抗炎、维持渗透压、稳定细胞膜等多种生物学功能。本试验以大鼠正常肝细胞系BRL3A细胞为研究对象,通过牛磺酸与氯化镉单独或联合处理细胞,检测细胞损伤和自噬相关指标,探究牛磺酸对镉引起的BRL3A细胞损伤的保护效应及内在机制,为进一步揭示镉的肝毒性机制及防治镉中毒提供理论依据。1.牛磺酸对镉致BRL 3A细胞损伤的保护作用为了探讨牛磺酸在镉致BRL3A细胞损伤中的作用,本研究通过牛磺酸与镉单独或联合处理细胞,用倒置荧光显微镜观察细胞形态,细胞实时分析系统（Real-time cell analysis,RTCA）检测细胞指数,Edu-488试剂盒检测细胞增殖能力。结果表明:不同浓度牛磺酸（0、40、80、160 mM）对BRL3A细胞形态和增殖情况没有明显影响;80 mM牛磺酸可以缓解镉引起的BRL3A细胞形态学损伤和细胞指数的下降,提高细胞的增殖能力。2.牛磺酸缓解镉引起的BRL 3A细胞自噬流阻滞为了探讨牛磺酸是否可以通过调节自噬流缓解致BRL3A细胞的损伤,本试验以80 mM牛磺酸与5 μM镉单独或联合处理细胞6 h,透射电子显微镜观察自噬小体的变化,激光共聚焦显微镜观察RFP-GFP-LC3荧光聚点、自噬标志蛋白LC3与溶酶体膜蛋白LAMP2共定位的变化,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、P62、Atg5、Beclin-1的表达水平。结果显示:5μM镉处理细胞6 h后,细胞中自噬小体数量明显增多,RFP-GFP-LC3黄色荧光聚点增多、LC3与LAMP2共定位明显减少,自噬相关蛋白LC3、P62、Atg5表达量极显著增加（P＜0.01）、Beclin-1表达量显著增加（P＜0.05）;与镉组相比,牛磺酸与镉共处理组自噬小体数量减少、自噬溶酶体数量增加,RFP-GFP-LC3黄色荧光聚点减少、LC3与LAMP2共定位增多,自噬相关蛋白LC3、P62、Atg5表达量极显著降低（P＜0.01）,Beclin-1表达量显著降低（P＜0.05）。结果表明,牛磺酸通过促进自噬体与溶酶体融合、减少自噬体的生成缓解镉引起的自噬流阻滞。3.牛磺酸缓解镉致BRL3A细胞自噬流阻滞的作用机制为了探讨牛磺酸是否可以通过调节溶酶体功能来缓解镉致BRL3A细胞的自噬流阻滞,本试验以80 mM牛磺酸与5μM镉单独或联合处理细胞6 h,Lyso-Tracker Red（LTR）荧光染色来观察细胞溶酶体酸性环境的变化,DQ-BSA-Green降解实验检测溶酶体降解功能,免疫印迹法检测溶酶体膜蛋白（Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2）、组织蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）的表达。结果显示:与对照组相比,牛磺酸单独处理组LTR红色荧光和DQ-BSA绿色荧光有所增强、CTSB表达量极显著增加（P＜0.01）;镉单独处理组LTR红色荧光显著增强、DQ-BSA-Green降解实验释放出的绿色荧光片段增多,LAMP2表达量显著增加（P＜0.05）、CTSB表达量极显著增加（P＜0.01）。与镉单独处理组相比,牛磺酸与镉共处理组LTR红色荧光有所减弱,DQ-BSA绿色荧光略微增强。结果表明,牛磺酸可以在一定程度上促进溶酶体酸化、增强溶酶体降解功能,但并不是其在缓解镉致BRL3A细胞自噬流阻滞中的主要作用机制。本试验采用不同浓度的镉（0、2.5、5、10μM）处理细胞6h,WB检测STX17、SNAP29、VAMP8的表达水平。结果显示:与对照组相比,STX17蛋白表达水平仅在2.5μM镉暴露6h时极显著升高（P＜0.01）,整体无显著变化;SNAP29表达水平极显著升高（P＜0.01）,且在5μM镉暴露6h时表达水平最高;VAMP8表达水平呈浓度依赖性降低。为了进一步探讨牛磺酸缓解镉致BRL3A细胞自噬流阻滞的作用机制,本试验以80 mM牛磺酸与5 μM镉单独或联合处理细胞6 h,免疫荧光法分别检测LC3与膜融合蛋白 STX17（syntaxin 17）、SNAP29（synaptosomal associated protein 29）共定位,VAMP8（vesicle-associated membrane protein 8）与 LAMP2 共定位。结果显示:与对照组相比,镉单独处理组LC3与STX17、SNAP29共定位,VAMP8与LAMP2共定位均减少;与镉单独处理组相比,牛磺酸与镉共处理组LC3与STX17、SNAP29共定位,VAMP8与LAMP2共定位均增加。结果表明:镉影响SNARE蛋白的表达,同时镉抑制SNARE蛋白STX17向自噬体的转移,进而影响STX17-SNAP29二元复合物的形成;镉还下调VAMP8的表达,同时抑制VAMP8向溶酶体的转运。牛磺酸可促进STX17向自噬体转移,从而促进STX17-SNAP29二元复合物的形成,同时也促进VAMP8向溶酶体的转运。这些都可以促进自噬体与溶酶体的融合从而缓解镉引起的BRL3 A细胞的自噬流阻滞。综上所述,镉暴露可致肝细胞损伤,牛磺酸通过促进膜融合蛋白STX17、SNAP29向自噬体转移、VAMP8向溶酶体转运,促使自噬体与溶酶体融合,缓解自噬流阻滞,进而减轻镉暴露引起的肝细胞损伤。