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脑卒中是一类发病率、致残率和死亡率均很高的神经系统疾病,已成为全球性公共卫生问题。在大多数国家,脑卒中是第二或第三最常见的死亡原因,也是成人后天性残疾的主要原因之一。血管阻塞所导致的急性缺血性脑卒中是脑卒中的主要形式,占脑卒中总数的80%左右。目前,世界各国的脑卒中疾病负担均呈上升趋势,然而临床上对脑卒中的治疗仅限于应用溶栓性化学药物或者机械溶栓法溶解血栓以实现血流再通,其实际疗效并不显著,仍有超过2/3的存活者留下残疾的后遗症,这主要是因为血流恢复后缺血组织发生了缺血再灌注损伤的缘故。因此,对卒中后脑缺血再灌注损伤机制的阐明和据此探索新的更为有效的治疗方法具有重要意义。前期研究显示,大脑缺血可导致脑内铁离子聚集增加,进而造成神经损伤。微管相关蛋白tau参与了细胞内铁离子外排的调节。 本研究采用大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型和金属离子分析技术、免疫组化、免疫印迹等方法系统研究了铁离子代谢障碍在局灶性大脑缺血再灌注损伤中的作用及tau蛋白介导的铁转运异常在其中的调节机制,并探讨了相应实验性干预的效果。其结果如下:⑴大鼠大脑中动脉梗塞1.5小时再灌注6小时后缺血侧大脑半球铁离子水平显著升高,铜和锌等其他金属离子无显著变化。⑵靶向铁离子干预治疗:中度铁离子螯合剂CQ预处理显著减小缺血侧大脑半球缺损面积,同时提高缺血侧海马组织CA1区神经元存活率,减轻缺血再灌注损伤,抑制缺血侧大脑半球铁离子水平的升高;特异性铁离子螯合剂SIH能够有效阻止小鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤;协助铁离子转运的活性蛋白Cp和APPec对缺血再灌注脑组织有保护作用,能够阻止缺血侧大脑半球铁离子的聚集,而不影响非缺血侧铁离子水平。⑶特异性铁死亡抑制剂Liproxstatin-1和Ferrostatin-1能够有效阻止缺血再灌注损伤且具有剂量依赖性;15-LOX-1特异性抑制剂ML351也能有效减轻大脑局灶性缺血再灌注损伤。⑷在大鼠和小鼠MCAO模型,缺血再灌注期间缺血组织内可溶性tau蛋白含量显著下降,与铁离子水平呈负相关;铁离子螯合剂和协助铁离子输出的相关活性蛋白虽对缺血再灌注损伤有保护作用,但不能逆转可溶性tau蛋白水平的下降。⑸3月龄年轻tau基因敲除小鼠脑缺血再灌注后缺血半球损伤面积较对照野生型小鼠显著减小,且缺血侧海马组织内铁离子水平与未缺血侧无显著差异;tau基因敲除可显著减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤。⑹12月龄年老tau基因敲除小鼠海马组织内铁离子基础水平已显著高于野生型对照小鼠,tau缺失不能保护大脑免受缺血再灌注损伤,其缺血半球损伤面积与对照野生型小鼠无明显差异;协助铁离子转运的活性蛋白Cp的应用能够有效减轻老龄小鼠缺血再灌注损伤,且对tau基因敲除小鼠保护作用更为显著。本研究结果显示,大脑缺血再灌注造成可溶性tau蛋白的大量丢失,使得tau介导的铁转运功能发生障碍,从而使神经细胞内铁离子异常聚集,富集的铁离子通过铁死亡途径导致神经细胞大量死亡,介导脑缺血再灌注损伤。对于青年tau基因敲除小鼠,正常情况下,其大脑内铁离子稳态平衡可以通过其他非tau系统的代偿来维持;急性缺血时,由于没有tau蛋白的表达,急性缺血不能通过诱导tau蛋白的丢失使铁离子发生聚集,从而减轻了神经细胞发生铁死亡的风险,因此缺血侧大脑半球缺损面积显著减小。但对于老龄tau基因敲除小鼠,由于老化导致的代偿功能失调,其脑内通过其他非tau系统来代偿性维持的铁离子稳态平衡遭到破坏,正常情况下脑内已出现铁离子的聚集,在这种铁富集的环境下,大脑一旦遭受急性缺血等重创,处于应激状态的神经细胞便在短期内失去对高铁环境的耐受,从而发生铁死亡。本研究提示:Tau介导的铁转运功能异常导致缺血再灌注期间铁超载在缺血性脑损伤中发挥重要作用,对tau蛋白和铁离子的干预有望成为治疗脑卒中的新靶点。本研究分为两个部分: 第一部分:铁超载在大脑局灶性缺血再灌注损伤中的作用。 临床研究表明,在缺血性脑卒中血流恢复后发生的铁稳态失衡可影响血管再通后组织、器官结构和功能的恢复,但铁离子介导神经毒性的作用及机制仍未完全阐明。本研究中,我们采用MCAO模型造成动物脑缺血再灌注损伤,通过金属离子分析技术、免疫组化等方法,系统研究了大脑缺血再灌注时铁超载导致神经细胞发生死亡的途径和机制。其结果如下:⑴大鼠大脑中动脉梗塞1.5小时再灌注6小时后缺血侧大脑半球铁离子水平显著升高,铜和锌等其他金属离子无显著变化。⑵中度铁离子螯合剂CQ预处理后显著减小缺血侧大脑半球缺损面积,同时提高缺血侧海马组织CA1区神经元存活率,抑制缺血侧大脑半球铁离子水平的升高。⑶特异性铁离子螯合剂SIH能够有效阻止小鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤;⑷协助铁离子转运的活性蛋白Cp和APPec对缺血再灌注脑组织有保护作用,能够阻止缺血侧大脑半球铁离子的聚集,而不影响非缺血侧铁离子水平。⑸特异性铁死亡抑制剂Liproxstatin-1和Ferrostatin-1能够有效阻止缺血再灌注损伤且具有剂量依赖性;15-LOX-1特异性抑制剂ML351也能有效减轻大脑局灶性缺血再灌注损伤。本研究结果显示,铁超载是局灶性大脑缺血再灌注后神经细胞损伤的主要原因,富集的铁离子通过铁死亡途径导致神经细胞大量死亡;干预铁死亡途径可有效逆转脑缺血再灌注损伤,改善神经功能缺损的症状。 第二部分:Tau介导的铁转运功能异常导致缺血再灌注期间铁超载。 局灶性大脑缺血再灌注期间发生铁超载并介导神经元损伤,但铁超载的上游机制不明。前期研究表明微管相关蛋白tau参与了细胞内铁离子外排的调节。本研究探讨了大脑缺血再灌注期间神经细胞内铁超载与可溶性tau蛋白之间的关系以及tau介导的铁转运在大脑局灶性缺血再灌注损伤中的作用。其结果如下:⑴缺血再灌注期间缺血组织内可溶性tau蛋白含量显著下降而协助铁转出细胞的其他几种蛋白无显著变化,且可溶性tau蛋白含量与铁离子水平呈负相关;铁离子螯合剂和协助铁离子输出的相关活性蛋白虽对缺血再灌注损伤有保护作用,但不能逆转可溶性tau蛋白水平的下降。⑵3月龄tau基因敲除小鼠脑缺血再灌注后缺血半球损伤面积较对照野生型小鼠显著减小,且缺血侧海马组织内铁离子水平与未缺血侧无显著差异;tau基因敲除可显著减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤。⑶12月龄年老tau基因敲除小鼠大脑缺血再灌注后缺血半球缺损面积与野生型无明显差异,且12月龄tau基因敲除小鼠海马组织内铁离子基础水平已显著高于野生型对照小鼠,tau缺失不能保护大脑免受缺血再灌注损伤,其缺血半球缺损面积与对照野生型小鼠无明显差异。协助铁离子转运的活性蛋白Cp的应用能够有效减轻老龄小鼠缺血再灌注损伤,且对tau基因敲除小鼠保护作用更为显著。结果显示,大脑缺血再灌注造成可溶性tau蛋白的大量丢失,使得tau介导的铁转运功能发生障碍,从而使神经细胞内铁离子异常聚集,富集的铁离子通过铁死亡途径导致神经细胞大量死亡,介导脑缺血再灌注损伤。对于青年tau基因敲除小鼠,正常情况下,其大脑内铁离子稳态平衡可以通过其他非tau系统的代偿来维持;急性缺血时,由于没有tau蛋白的表达,急性缺血不能通过诱导tau蛋白的丢失使铁离子发生聚集,从而减轻了神经细胞发生铁死亡的风险,因此缺血侧大脑半球缺损面积显著减小。但对于老龄tau基因敲除小鼠,由于老化导致的代偿功能失调,其脑内通过其他非tau系统来代偿性维持的铁离子稳态平衡遭到破坏,正常情况下脑内已出现铁离子的聚集,在这种铁富集的环境下,大脑一旦遭受急性缺血等重创,处于应激状态的神经细胞便在短期内失去对高铁环境的耐受,从而发生铁死亡。本研究提示:Tau介导的铁转运功能异常导致缺血再灌注期间铁超载在缺血性脑损伤中发挥重要作用,对tau蛋白的干预有望成为治疗脑卒中的新靶点。