广西玉米黄曲霉菌生物多样性研究及新型复合材料在减轻真菌毒素污染中的应用

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广西位于中国西南部,是中国最大的玉米产区之一。由于气候炎热潮湿,广西玉米容易受到对人和动物都具有毒性及极高致癌性的黄曲霉毒素污染。长期以来,对该玉米产区的黄曲霉真菌多样性缺乏研究。因此,有必要开展广西黄曲霉真菌生物多样性调查研究,通过采集、分离菌种及对黄曲霉毒素进行检测,为该地区真菌毒素的防控提供策略。本研究分为四个主要部分,一是采用形态学、化学和分子生物学相结合的方法,对广西玉米主产区曲霉属真菌生物多样性和主要种群的产毒特性进行研究。应用多相分类方法鉴定玉米籽粒中的曲霉菌株,评估其产生不同真菌毒素的情况,二是利用橙皮提取物制备新型有机-无机膨润土复合材料,并进行真菌毒素吸附研究。三是利用有机酸单宁酸作为改性剂,制备改性膨润土,在水溶液和模拟胃肠道液中进行霉菌毒素吸附脱除研究,四是使用樱桃和蓝莓果渣从水溶液,胃肠液和酒中去除黄曲霉毒素研究。主要研究结果如下:1.通过对广西6个市的玉米主产区进行曲霉菌多样性调查,分离出黄曲霉菌株共195株,采用多相方法对其进行鉴定,首先进行形态学鉴定,在不同培养基上接种,于不同温度下进行培养,并在显微镜下观察测量显微特征,再采用ITS,Ben A和Ca等3个基因片段进行分子序列分析,构建系统发育,同时利用HPLC和LCMS对菌株进行真菌毒素化学分型和含量分析,经多相鉴定,所分离的菌种鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus)、花生曲霉(A.arachidicola)、新寄生曲霉(A.novoparasiticus)、假集蜂曲霉(A.pseudonomius)等,其中黄曲霉分布最广,有192株,其余3种均只有1株,全部菌株都属于曲霉属黄绿组。根据其产毒素类型的不同,有的黄曲霉菌株可产生多种化学型毒素,有的仅产生圆弧偶氮酸(CPA)毒素,而假集蜂曲霉的黄曲霉毒素含量最高,除黄曲霉外其余3种均不产生圆弧偶氮酸。多相鉴定方法可对产毒曲霉真菌进行准确鉴定。毒素分析还表明,黄曲霉菌株产黄曲霉毒素的同时可高含量的圆弧偶氮酸,提示我们在注意黄曲霉的同时也要关注圆弧偶氮酸。2.以橙皮的乙醇、甲醇和水提取物为改性剂,对膨润土进行改性和修饰,制备了一种有机-无机复合膨润土材料。利用制备的新型材料进行黄曲霉毒素B1(AFB1),赭曲霉毒素(OTA),伏马菌素B1(FB1)等真菌毒素的吸附和脱毒研究。采用比表面积测试(BET)、红外光谱仪(FT-IR)、X射线衍射仪(XRD)、热分析仪(TGA)、扫描电镜(SEM)、能量散布X光分析(EDX)、X射线光电子能谱分析(XPS)等技术对制备的材料进行结构表征分析,并研究了溶液p H值(2.5和7)、初始浓度、剂量等对去除毒素效果的影响,探讨吸附剂结合AFB1的机制。结果表明,改性膨润土在不同p H缓冲液下的等温吸附符合Freundlich模型,探讨吸附剂对AFB1的吸附规律和机理。发现新型吸附剂对黄曲霉毒素B1的最大吸附容量分别为166 mg/g和121 mg/g,对伏马菌素B1的最大吸附量为3.87 mg/g和1.78 mg/g,对赭曲霉毒素的最大吸附量为1.97 mg/g和3.19 mg/g。所制备的有机-无机复合膨润土材料能有效去除环境中单一或多种真菌毒素。3.以天然有机酸单宁酸为改性剂,对膨润土进行改性,以改性的膨润土为吸附剂,用于吸附AFB1、AFB2、AFG1、AFG24等4种黄曲霉毒素,采用前述的表征方法对制备的新型材料进行了表征,并对吸附反应的参数如p H、用量、动力学、热力学等进行优化,测试重金属、腐殖酸、废水、黄曲霉毒素等环境因素对吸附反应的影响。结果表明,供试的黄曲霉毒素在改性膨润土上的吸附行为较好地服从Langmuir等温吸附模型,对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的最大平衡吸附量分别为86 mg/g、71 mg/g、74 mg/g和149 mg/g。吸附研究还发现,当4种黄曲霉毒素同时存在时,改性材料对特定种类的黄曲霉毒素的吸附去除不受影响。4.以樱桃和蓝莓果渣及其果汁发酵的酒精渣为原料,分别制备黄曲霉毒素生物吸附剂,为黄曲霉毒素的生态友好防治和果业加工废弃物的回收利用提供了参考。通过材料表征,优化了吸附反应的不同参数。为了进一步扩大吸附剂的应用范围,还在胃肠液和模型酒中进行了吸附反应。该生物吸附剂具有吸附反应放热快的动力学特性。乙醇对模型酒的吸附率略有下降,肠液对模型酒的吸附率高于缓冲液对模型酒的吸附率。Langmuir、Freundlich和Sips模型都能很好地描述真菌毒素在新型材料上的吸附行为,不同模型的等温数据拟合呈现的趋势为Sips>Langmuir>Freundlich模型,其中根据Sips模型计算得出的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的理论最大吸附量分别为4.6 mg/g、2.9 mg/g、2.7 mg/g和2.4 mg/g。综上所述,本研究为曲霉属产毒真菌的准确鉴定提供了一种适用性、可操作性很强的多相鉴定方法,所制备的几种新型吸附剂对真菌毒素的脱除具有很好的效果,这些吸附剂在食品加工和农业种植中均具有良好的应用前景的。
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