研究背景和目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,会引起一系列肝脏疾病,如急性或慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前针对HBV感染相关疾病的诊疗计划是根据血清和生化学指标来制定的,如HBVDNA、ALT、AST、HBsAg、HBcAg等。然而,这些指标受很多因素影响,如指标本身的特异性、药物治疗等,因此,非常迫切需要能完全反应乙型肝炎病情严重程度的分子标志。据研究显示,ConA诱导的肝衰竭早期阶段,LCN2、Tim3、MIP2和iNOS明显升高,并且LCN2主要是由肝细胞分泌产生,IL-1β是诱导LCN2分泌的关键细胞因子。此外,自噬促进IL-1β的分泌,Ran在自噬中的作用及机制不明。本研究的目的主要是探索这些指标是否能反映HBV感染相关疾病的严重程度,并深入阐明LCN2对肝细胞的保护作用及机制以及Ran在自噬中的作用及机制。第一部分:探索LCN2、Tim3、MIP2和iNOS在判断HBV感染相关疾病严重程度的作用研究方法:总共收集6组患者血清样本,分别为健康对照组、乙肝携带组、慢性乙型肝炎轻度组、慢性乙型肝炎中度组、慢性乙型肝炎重度组、肝衰竭组。通过ELISA方法检测LCN2、Tim3、MIP2和iNOS蛋白在各组之间的表达量的差异,并且分析了现有实验室所有指标间的相关性。此外,对各组按ALT、TBIL、DBIL正常或异常进行细分后,评估LCN2、Tim3、MIP2和iNOS对疾病程度的判断。研究结果:1.Tim3和MIP2表达量随着慢性乙型肝炎轻中重度而增加,6组间的Tim3水平均有显著差异。然而,MIP2在健康人与乙肝携带者或慢性乙型肝炎轻度患者却无明显的差异。与其他组相比,LCN2在慢性乙型肝炎重度患者中明显升高,iNOS在肝衰竭组水平明显升高。2.上述4个指标与传统的实验室指标均有不同程度相关性,如Tim-3与MIP2、ALB、TBIL 和 DBIL 的 r 值分别是 0.498、-0.49、0.487 和 0.535。并且,MIP2与 TBIL(r =-0.484)和 ALB(r =-0.564)负相关,与 ALT(r = 0.501)、AST(r =0.597),TBIL(r = 0.584)、DBIL(r = 0.632)和 IBIL(r = 0.538)正相关。3.在DBIL和TBIL升高、ALT正常或者异常时,Tim3和MIP2都可以很好的将肝衰竭与慢性乙型肝炎中重度患者区分开来。无论DBIL、TBIL和ALT正常或者异常时,MIP2均随着慢性乙型肝炎轻中重度逐渐升高。当ALT正常时,LCN2除不能区别慢乙肝轻中重度外,其余各组间均有显著差异。第二部分:阐明LCN2对肝细胞的保护作用及机制研究方法:使用RNA干扰技术,用LCN2-siRNA转染Huh7细胞,下调LCN2表达后观察LCN2对IL-1β诱导的肝细胞损伤的影响。此外,通过基因芯片技术分析LCN2干扰组与阴性对照组间的差异性表达,并通过荧光定量PCR验证,从而阐明LCN2对IL-1β诱导的肝细胞损伤的保护作用机制。研究结果:1.IL-1β刺激Huh7细胞,导致LCN2、IL-6和TNF-α在mRNA和蛋白水平的表达均有明显增加。2.干扰Huh7细胞中LCN2的表达后,IL-6和TNF-α在mRNA和蛋白水平升高的更高3.与阴性对照组相比,有180个基因上调,268个基因下调。差异表达的基因主要涉及13个生物学过程。第三部分:Ran在自噬中的作用及其机制研究方法:我们分别通过流式、cck8和transwell实验检测Ran下调后对肿瘤细胞凋亡、增殖和侵袭的影响。此外,使用WB或免疫荧光观察Ran下调后自噬的改变以及对自噬相关基因sirt1、ATG5和ATG7的影响。研究结果:1.干扰Ran后肿瘤细胞增殖和浸润减少。2.自噬发生时,Ran的定位由细胞核内转向核外。3.干扰Ran后自噬减弱,不影响凋亡。4.Ran通过sirt1调节自噬,对自噬相关基因ATG5和ATG7无影响。研究结论:1.ALT,DBIL和Tim3在健康人、乙肝携带者、慢性乙型肝炎轻中重度和肝衰竭组均有显著差异。ATL正常时,LCN2联合MIP2可以有助于判断HBV感染不同疾病状态。2.LCN2上调在IL-1β诱导的肝细胞刺激中发挥肝细胞保护作用。基因芯片数据进一步揭示LCN2通过调节压力应激、蛋白代谢、细胞周期和增殖发挥肝脏保护作用。3.Ran可能是通过sirt1调节细胞自噬,从而影响肝癌进程。