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目的:通过对毛橘红总黄酮(CGTF)进行质量控制,确保其质量稳定、可控的条件下,研究CGTF对酒精性脂肪肝L 02细胞模型的影响,初步探讨其抗酒精性脂肪肝的药效和作用机制,为CGTF的开发提供研究基础和科学依据。方法:1.采用水提醇沉法对CGTF进行提取分离,应用分光光度法测定CGTF含量,应用UPLC法测定CGTF中柚皮苷含量,并对不同品种药材的CGTF指纹图谱进行研究,通过以上指标综合对CGTF进行质量控制。2.体外培养L 02细胞,采用MTT法筛选乙醇诱导L 02肝细胞脂肪变性的适宜浓度以及CGTF进行干预的最适浓度;采用倒置显微镜观察空白组、模型组、给药组细胞形态,并检测各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用AnnexinV/PI试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用油红O染色法通过倒置显微镜观察不同组别细胞中脂滴生成情况,并采用酶标仪-试剂盒法检测细胞培养基中谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)泄露量以及细胞内甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平;并通过酶标仪-试剂盒法检测抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,以及丙二醛(MDA)含量:采用荧光分光光度法检测细胞内活性氧(ROS);采用Western-blot法检测各组细胞中固醇调节元件结合蛋白-1 c(SREBP-1 c)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-α)蛋白的表达量。结果:1.制备得到质量均一、稳定的CGTF本课题采用醇水处理法对CGTF进行提取分离,工艺路线简单,精制工艺少,适合工业化生产;提取出的总黄酮直接与铝盐反应显色进行含量测定,方法简便易行,提取率均在80%以上;对4批CGTF提取物中柚皮苷含量进行分析,发现柚皮苷含量均占总黄酮提取物的73.16%～80.09%之间;对11批不同品种来源的CGTF进行指纹图谱分析,结果显示,其有15个共有峰,各共有峰保留时间一致,RSD均小于0.2%,而峰面积有较大差异,但共有峰面积均占总面积99%以上,其中8号峰为柚皮苷,10号峰为野漆树苷,11号峰为柚皮素。2.CGTF对乙醇体外诱导脂肪变性L 02细胞的影响结果2.1酒精以及CGTF对L 02细胞增殖的影响:MTT实验显示,0.3%乙醇对L 02细胞增殖有促进作用,0.6%乙醇作用后细胞存活率均在80%以上,随着酒精浓度逐渐增大,细胞存活率逐渐下降,并随时间延长而加剧,因此选用0.6%的乙醇浓度作为最适浓度。CGTF干预组剂量低于250μg/mL时,促进L02细胞增殖,但规律性不明显。但随着浓度增加,超过250μg/mL时,结晶析出,细胞浓度达到1000μg/mL时,结晶大量析出,但细胞存活率仍在70%以上,说明CGTF低毒性的特点。2.2 CGTF对酒精性脂肪肝L 02细胞模型常规指标的影响:油红O染色结果显示,对比空白组,模型组细胞肿胀明显,胞浆内含有大小不一被染成橘红色的脂滴,CGTF干预组与模型组相比,细胞内脂滴数量和大小均有所减轻,并呈现一定的剂量依赖性;用0.6%乙醇干预L 02细胞后,与空白组相比培养液中AST、ALT泄漏量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01),CGTF干预组与模型组相比,浓度为10μg/mL时,上述指标含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),当浓度大于10μg/mL时,差异异常显著(P<0.01);TG检测结果显示,模型组对比空白组,差异具有统计学意义(P<0.01),提示已成功制备酒精性脂肪肝细胞模型,不同浓度CGTF进行干预后,浓度为10μg/mL时,差异有统计学意义(P<0.05),当浓度大于10μg/mL时,差异异常显著(P<0.01);TC检测结果显示,模型组与空白组相比,差异具有显著性(P<0.05),CGTF浓度为100μg/mL时,差异有统计学意义(P<0.05),当浓度为250μg/mL时,差异异常显著(P<0.01)。2.3 CGTF对酒精性脂肪肝L 02细胞模型损伤的影响:L 02细胞形态学观察显示模型组相对空白组细胞量相对减少、且细胞略显肿胀,CGTF干预组细胞形态与正常组相似;LDH测定结果显示模型组与空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),用浓度为10Oμg/mL和250μg/mL进行干扰时,与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);Annexin-Ⅴ/PI细胞凋亡实验结果显示,0.6%酒精浓度诱导细胞,模型与空白组相比,差异没有统计学意义(P>0.05),干预组与模型组相比,其凋亡率降低不显著,差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.4 CGTF对酒精性脂肪肝L 02细胞模型氧化应激水平的影响:氧化应激指标检测结果发现,SOD模型组与空白组相比,差异具有统计学意义,(P<0.05),当CGTF浓度为250μg/mL时,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05);模型组肝细胞内的GSH含量与空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),当浓度为100μg/mL和250μg/mL时,与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05);MDA检测结果发现,模型组与空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),当CGTF浓度为100μg/mL和250μg/mL时,与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05);ROS检测结果显示,模型组与空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),当浓度为50μg/mL、100μg/mL和250μg/mL时,与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。2.5 CGTF对酒精性脂肪肝L 02细胞模型保护作用机制研究:Western Blot检测CGTF干预酒精诱导L 02脂肪肝细胞模型中SREBP-1c和PPAR-α蛋白表达量。SREBP-1c蛋白测定结果显示模型组与空白组相比,SREBP-1c蛋白表达量增加(P<0.01),CGTF干预组与模型组比较,随CGTF浓度增加,SREBP-1c蛋白表达量降低,浓度高于10μg/mL时,差异具有显著性(P<0.05),当浓度大于10μg/mL时,差异异常显著(P<0.01),并呈现一定的剂量依赖性;PPAR-α蛋白测定结果显示,模型组与空白组相比,差异具有统计学意义(P>0.05),CGTF浓度高于10μg/mL时,PPAR-α蛋白表达量增加,并且差异具有显著性(P<0.01)。结论:1.CGTF质量可控、均一本实验制备的CGTF为淡黄色或黄绿色粉末,味苦。粉末中总黄酮含量不低于80%,柚皮苷含量不低于73%,不同品种CGTF指纹图谱具有15个共有峰,各共有峰保留时间一致,共有峰总面积占99%以上,相似度在0.98以上,。2.CGTF可能是通过保护细胞损伤、抗氧化应激、参与调节与脂肪代谢有关的酶类等综合作用保护酒精性脂肪肝L 02细胞模型。MTT实验结果提示用0.6%(V/V)的酒精进行诱导L 02细胞造模,选择10、50、100和250μg/mL的CGTF进行干预。油红O染色实验以及AST、ALT、TG、TC等检测结果均显示造模成功,且操作简单,时程短,不同浓度CGTF进行干预后,各指标病变程度均有所减轻。实验从保护细胞损伤角度探讨了 CGTF对酒精致L 02脂肪肝细胞模型的保护作用,0.6%酒精通过增加LDH含量造成细胞损伤,但未引起细胞凋亡,CGTF可通过降低LDH防止L 02细胞损伤,但对0.6%酒精作用下的细胞凋亡影响不大。从CGTF抗氧化应激角度讲,0.6%的酒精可以造成细胞内氧化应激,细胞内ROS、MDA含量增加,并且降低抗氧化物的含量;CGTF可以通过提高细胞抗氧化物质水平—GSH和SOD的含量,并降低MDA和ROS的含量来提高细胞抗氧化能力。从CGTF对参与调节与脂肪代谢有关的酶类的影响角度讲,酒精作用导致参与脂肪代谢的SREBP-1c上调和PPAR-α蛋白下调,而CGTF可以抑制SREBP-1c蛋白表达、促进PPAR-α蛋白表达,使细胞脂肪代谢恢复正常,从而达到保护细胞的作用。