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目的：
糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的眼部并发症和致盲的主要原因之一。炎症反应和氧化应激是DR时内皮功能障碍、血管渗漏和新生血管形成的重要原因。我们首先探讨了洛伐他汀(Lovastatin)对DR保护作用的抗炎及抗氧化机制；同时阐明NADPH氧化酶4(Nox4)在糖尿病视网膜表达情况及其在DR血管渗漏和新生血管形成中的作用，并进一步探讨NADPH氧化酶4作为视网膜血管内皮细胞(RECs)内活性氧自由基(ROS)产生的主要来源对血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达及VEGF介导信号通路的影响。
方法：
(1)Lovastatin干预作用及机制研究：采用db/db小鼠作为DR动物模型，19周龄db/db小鼠按10 mg/(kg·d)剂量给予Lovastatin灌胃处理6周。采用Westernblot检测Lovastatin干预对糖尿病视网膜血管白蛋白渗漏、紧密连接蛋白Occludin、前炎症因子如细胞间粘附分子1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达以及Nox4和VEGF产生的影响。采用缺氧(2％ O2)处理RECs，观察Lovastatin对缺氧诱导的RECs中ICAM-1和TNF-α表达的作用。将RECs和/或人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)暴露于TNF-α，Western blot检测Lovastatin处理对ICAM-1及Occludin表达的作用，ICC或DNA结合活性分析检测Lovastatin预处理对TNF-α诱导的核因子-κB3活化的影响。ROS敏感荧光探针CM-H2DCFDA检测Lovastatin预处理对缺氧诱导的RECs中ROS产生的影响。给予下述氧化酶抑制剂预处理RECs：NADPH氧化酶抑制剂(DPI)、一氧化氮合成酶抑制剂(L-NAME)、黄嘌呤氧化酶抑制剂(Allopurinol)和线粒体电子传递链抑制剂(Rotenone)，观察其对缺氧诱导ROS产生的抑制作用。实时定量RT-PCR检测RECs中NADPH氧化酶异构体表达的主要形式。Western blot和/或ICC检测Lovastatin对缺氧诱导RECs中Nox4表达定位以及VEGF产生的影响。
(2)Nox4在DR血管渗漏中作用及机制的研究：通过玻璃体腔内注射Nox4siRNA腺病毒(Ad-Nox4i)敲除db/db小鼠视网膜Nox4表达，伊文思兰血管通透性分析检测db/db小鼠视网膜血管的渗漏情况，新鲜全眼球冰冻切片ROS敏感荧光探针CM-H2DCFDA检测db/db小鼠视网膜NADPH氧化酶的活性，Western blot检测db/db小鼠视网膜Nox4及VEGF表达水平。显性负突变Nox4腺病毒(Ad-Nox4△FAD)感染RECs抑制Nox4活性，用缺氧(2％O2)或高糖(25mM)处理感染后的RECs，Western blot检测VEGF和HIF1-α或p-STAT3的表达，ROS敏感荧光探针CM-H2DCFDA、DHE和amplex red检测缺氧或高糖诱导的细胞内、外ROS的产生。野生型Nox4腺病毒(Ad-Nox4WT)感染RECs，CM-H2DCFDA和amplex red分别观察细胞内、外ROS的产生，Western blot检测过表达Nox4对RECs中HIF1-α和VEGF产生的影响。
(3)Nox4在视网膜新生血管形成中作用及机制研究：建立高氧诱导的新生鼠视网膜病变模型(OIR)模拟糖尿病性视网膜新生血管。Western blot和/或ELISA检测视网膜血管闭塞阶段(p12)和新生血管形成阶段(p15或p17)视网膜Nox4和VEGF表达水平。IHC检测视网膜新生血管形成高峰(p17)时Nox4在OIR小鼠视网膜的表达定位。通过球周注射Ad-Nox4i载体敲除OIR小鼠视网膜Nox4的表达，异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(FITC-Dextran)血管造影和视网膜铺片定量OIR小鼠无血管区形成，全眼球石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色计数OIR小鼠视网膜前新生血管核的数目评价OIR小鼠视网膜新生血管形成的程度，Western blot检测OIR小鼠视网膜Nox4和VEGF表达水平。Ad-Nox4i感染RECs从基因水平敲除Nox4表达，将RECs暴露于缺氧(2％ O2)，Western blot检测HIF1-α和VEGF的表达，DHE检测细胞内ROS的产生。基质胶(Matrigel)体外检测RECs的管腔形成能力，跨膜迁移试验(Transwell assay)评价RECs的移行功能。此外，通过Western blot检测Nox4对VEGF介导的促分裂原活化激酶(MAPK)信号通路中ERK1/2和p38活化的作用。
结果：
(1)与同窝对照小鼠相比db/db小鼠视网膜Nox4表达上调并与ICAM-1、TNF-α和VEGF水平升高以及视网膜屏障破坏和血管渗漏相一致(p＜0.05或p＜0.01)。Lovastatin处理后明显减轻db/db小鼠视网膜血管渗漏和抑制Occludin表达下调并降低ICAM-1、TNF-α、VEGF和Nox4表达(p＜0.05或p＜0.01)。体外研究发现Lovastatin处理明显抑制缺氧诱导的RECs中前炎症因子ICAM-1和TNF-α表达(p＜0.05)。此外，我们还发现Lovastatin处理抑制TNF-α诱导的ARPE-19中核因子-κB活化(p＜0.05)以及降低TNF-α诱导的RECs和APRE-19中ICAM-1的表达(p＜0.05)。体外培养的RECs中，Nox4的mRNA水平高出其他NADPH氧化酶异构体数百倍，其蛋白表达在RECs中呈核周分布并受缺氧调节，Lovastatin处理后明显抑制缺氧诱导Nox4和VEGF的表达并降低缺氧介导的细胞内ROS产生(p＜0.05或p＜0.01)。
(2)玻璃体腔注射Ad-Nox4i从基因水平敲除Nox4的表达可以明显抑制db/db小鼠视网膜VEGF的表达(p＜0.01)、减少ROS的产生(p＜0.05)并缓解了视网膜血管渗漏(p＜0.05)。感染Ad-Nox4△FAD抑制Nox4活性分别通过HIF1-α和p-STAT3依赖的机制抑制缺氧或高糖诱导的RECs中ROS产生和VEGF表达(p＜0.01或p＜0.05)。感染Ad-Nox4WT过表达Nox4显著升高RECs中ROS的产生(p＜0.01)并上调HIF1-α和VEGF的水平(p＜0.05)。
(3)OIR小鼠高氧诱导的视网膜血管闭塞阶段Nox4表达下调(p＜0.05)而视网膜新生血管形成阶段Nox4表达明显升高(p＜0.01)，与VEGF表达变化趋势相一致。免疫组织化学显示OIR小鼠视网膜新生血管形成高峰Nox4主要表达于视网膜内界膜玻璃体面的新生血管处，此外视网膜内核层及外丛状层处视网膜固有血管Nox4表达也上调。应用Ad-Nox4i从基因水平敲除视网膜Nox4的表达可以明显抑制OIR小鼠视网膜无灌注区(p＜0.05)及新生血管的形成(p＜0.01)并降低视网膜VEGF的表达(p＜0.05)。感染Ad-Nox4i后明显抑制缺氧诱导的RECs中ROS产生(p＜0.01)以及HIF1-α和VEGF表达。此外，感染Ad-Nox4i敲除RECs中Nox4表达可以明显降低VEGF诱导的RECs管腔形成(p＜0.01)和移行能力(p＜0.01)以及抑制VEGF诱导的ERK1/2和p38 MAPK磷酸化(p＜0.05)。
结论：
Lovastatin主要通过降低视网膜前炎症因子产生及抑制氧化应激反应发挥对糖尿病血-视网膜屏障功能的保护作用。Nox4作为RECs中ROS产生的重要来源，其在糖尿病视网膜中表达的上调介导了糖尿病视网膜血管渗漏和病理性视网膜新生血管的形成。从基因水平敲除视网膜Nox4表达可以明显降低糖尿病视网膜ROS的产生及VEGF的表达，并抑制糖尿病视网膜血管渗漏和病理性视网膜新生血管形成。通过本课题研究丰富了DR发生发展的分子机制，并为发掘DR生物治疗新靶点奠定基础。