背景：甲醛属较高毒性化学物,位居我国有毒化学品优先控制名单中的第二位。人体可经呼吸道或皮肤暴露于甲醛而引发多种损害。甲醛因为其污染来源广泛、毒性作用大并且污染时间长等特点,已经成为我国最主要的室内空气污染物之一,也是环境卫生领域和职业卫生领域研究的热点和难点。甲醛的遗传毒性表现为甲醛可以引起DNA损伤(包括DNA链断裂、DNA与DNA和蛋白质等大分子的交联、DNA加合物、RNA-formaldehyde加合物等)、基因突变、染色体断裂、姐妹染色单体互换、细胞转化以及通过破坏基因组抑制DNA的修复。损伤的DNA未被修复或修复不正确,将导致基因突变或染色体畸变,导致细胞坏死/凋亡,或发展为癌细胞。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)于2004年将甲醛确定为人类Ⅰ类致癌物。大量的流行病学研究显示,人类的许多常见癌症与长期的慢性炎症刺激有关,慢性炎症可导致细胞过度增殖和细胞级联反应活化,进而导致DNA的损伤,持续性刺激和炎症能够促进启动细胞向转移性疾病发展,最终导致肿瘤生长及免疫抑制。DNA损伤修复和炎症应激反应的信号传导网络对肿瘤发生的信号通路的影响,及其所介导的炎症在肿瘤发展中的作用至今还是信号通路研究的热点之一。多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA损伤的感应器及监测分子,在DNA修复中发挥至关重要的作用。除了DNA损伤识别功能,PARP-1还可以通过调控转录因子、细胞因子、粘附因子和炎性介质等方式参与炎症的过程。同时,PARP-1还在调控基因组的甲基化状态的过程中发挥着重要作用。因此,本研究将从DNA损伤修复、免疫调控和甲基化调控三个方面全面评价PARP-1在甲醛诱导的早期健康损害效应中的作用,本研究对预防和监测甲醛的有害健康效应具有重大意义。目的：本研究采用横断面分子流行病学设计,在118例甲醛暴露工人和79例非暴露工人中,主要探讨了不同甲醛暴露水平与工人外周血淋巴细胞遗传损伤和免疫失衡的关系。并进一步以人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cell Line,16HBE)为研究对象,探讨PARP-1信号通路在低浓度甲醛诱导的遗传损伤修复中的作用。方法：研究中,首先选择监测了山东省某木质板厂不同工作场所的空气甲醛浓度,采用彗星实验、胞质阻断双微核实验、流式细胞术等实验方法分别评价外周血淋巴细胞的DNA链断裂水平(彗星尾部DNA百分含量,Percent of DNA in the Comet Tail, TDNA%)、染色体断裂或丢失水平(胞质阻断双微核率,Percent of Cytokinesis-block Micronucleus, CBMN率)、外周血淋巴细胞亚型分布百分比及Thl (γ-干扰素Interferon γ,IFN-γ)、Th2(白介素-4和10Interleukin-4/10, IL-4和IL-10)和前炎性细胞因子(白介素-6和8Interleukin-6/8, IL-6、IL-8和α-肿瘤坏死因子,Tumor Necrosis Factor, TNF-α)表达水平,同时还用液相质谱检测班后尿中甲酸含量,分析现场甲醛暴露水平与工人外周血淋巴细胞遗传损伤和免疫失衡水平间的关系。进一步采用实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, QT-PCR)和MassArray质谱技术检测PARP-1和甲基化相关酶基因mRNA的表达及PARP-1基因启动子区甲基化状态,初步探索PARP-1和甲基化相关酶在甲醛引起的表观遗传学改变中的作用。我们选用16HBE细胞为研究对象,同样采用彗星实验、胞质阻断双微核实验、流式细胞术等实验分别检测低浓度甲醛诱导的DNA链断裂水平(TDNA%)、染色体断裂或丢失水平(CBMN率)、活性氧水平及Thl (IFN-γ)、Th2(IL-4和IL-10)和前炎性细胞因子(IL-6、IL-8和TNF-a)。同时采用Western Blot、QT-PCR和AP-1荧光素酶活性检测技术检测DNA损伤修复通路蛋白表达水平或活性,用免疫共沉淀方法检测蛋白之间相互作用情况,用特异化学抑制剂和分子抑制(显性失活突变技术和RNA干扰技术)的方法探索PARP-1通路蛋白在低浓度甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用。同时还检测了低浓度甲醛诱导的甲基化酶的表达水平及其与PARP-1蛋白的结合情况,进一步检测PARP-1基因启动子区甲基化状况,阐明PARP-1参与低浓度甲醛引起表观遗传改变的分子机制。结果：1、甲醛暴露致工人遗传损伤生物标志物研究118例甲醛暴露工人按其接触甲醛浓度高低不同分为高暴露组和低暴露组,我们发现甲醛高暴露组和低暴露组尿甲酸含量均显著高于对照组p=0.004和p<0.001)。与对照组相比,甲醛暴露工人PARP-1基因mRNA表达明显减低(p=0.003),而X射线损伤修复交叉互补基因-1(X-ray repair cross-complementing protein-1, XRCC-1) mRNA表达没有显著性改变。本研究在校正了年龄、性别、吸烟和饮酒等可能的影响因素后,甲醛高暴露工人外周血淋巴细胞TDNA%显著高于对照组。对照组、低暴露组和高暴露组TDNA%分别为8.39±0.18%、9.63+0.23%、11.55+0.22%。甲酰胺嘧啶-DNA-糖基化酶(formamidopyrimidine-DNA-glycosylase, FPG)处理后,甲醛低暴露组和高暴露组较对照组TDNA%分别增加21.20%和20.66%,差异具有统计学意义(p<0.05)。对照组、低暴露组和高暴露组的CBMN率分别为2.26±0.16‰,3.04+0.23%o,4.48+0.20‰。与对照组相比,甲醛高暴露组工人外周血淋巴细胞CBMN率显著增高。与对照工人相比,随着甲醛暴露浓度的增加,工人外周血淋巴细胞B细胞亚群(CD19+)百分比逐渐增加(p<0.01)。甲醛低暴露组的NK细胞亚群(CD56+)百分比显著增加(p=0.013),而高暴露组没有发现显著差异。总T细胞(CD3+),抑制性T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的百分比没有显著变化。甲醛暴露工人血清IL-10水平显著增高(低暴露组vs.对照,p=0.003；高暴露组vs.对照,p<0.001),并且高暴露组工人血清IL-10水平显著高于低暴露组工人(p=0.04)。与对照组相比,甲醛高暴露组工人血清IL-4水平显著增高(p=0.044),而低γ暴露组无显著差异。相反,随着甲醛暴露浓度增加,血清IFN-γ水平呈减低趋势,与对照组相比,高暴露组血清IFN-γ水平显著减低(p=0.037)。甲醛暴露工人血清IL-8水平显著低于对照组工人(低暴露组vs.对照,p<0.001；高暴露组vs.对照,p=0.007)。IFN-γ/IL-4比值可以反应Th1/Th2细胞发挥作用的一种平衡状态。本研究结果显示甲醛暴露组分泌的细胞因子IFN-γ/IL-4比值较对照组明显减低,差异有显著性。血清IL-6和TNF-α水平在甲醛暴露工人和对照工人之间没有显著差异。进一步分析血清细胞因子水平与尿甲酸之间的相关性发现,血清IL-10(rs=0.465,p<0.001),IL-4(rs=0.203,p=0.045),和IL-8(rs=-0.272,p=0.007)表达水平与尿甲酸含量显著相关,而IFN-γ水平与尿甲酸无显著相关性。与对照组工人相比,甲醛暴露组工人DNA甲基转移酶-1/3a(DNAmethyltransferases-1/3a, DNMT-1和DNMT-3a)基因的mRNA表达水平显著下降了,而DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferases-3b, DNMT-3b)表达水平没有显著差异。PARP-1基因启动子区甲基化检测结果显示,本研究所选的各CPG位点甲基化状况没有随着甲醛暴露而发生改变。2、PARP-1通路在甲醛诱导的人支气管上皮细胞遗传损伤修复中的机制研究甲醛处理16HBE细胞4h,各浓度组细胞间生存率没有明显变化(0、10、20、40、80、160μM)。甲醛处理16HBE细胞24h,随着浓度增高,细胞生存率降低,≥80μM的甲醛处理组,细胞生存率显著降低,和未处理组相比,差异具有统计学意义。用不同浓度甲醛处理细胞4个小时,彗星试验结果显示,甲醛在5μM时就可以引起16HBE细胞的DNA断裂,在10μM时断裂作用达到峰值。用10μM浓度甲醛处理16HBE细胞,与对照组相比,细胞微核率轻度增高,差异不显著。根据上述结果,在后续的实验过程中,我们选择10gM甲醛作为处理浓度。PARP-1通路蛋白表达水平检测结果显示10μM甲醛可使PARP-1、XRCC-1、磷酸化细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Protein Kinase, ERK)和磷酸化c-JunN端激酶(c-Jun NH2-terminal Amino Kinase, JNK)表达明显增加,而磷酸化P38在各时间点(1,3,6,12,24h)变化均不明显。用10μM甲醛分别处理细胞0、12、24h,观察活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)活性变化,结果显示,与对照相比,AP-1活性在12h和24h时间点轻度增强,但未发现显著性差异。10μM甲醛处理细胞早期,在1和3小时时间点检测到毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM)蛋白表达显著增加。磷酸化P53蛋白随着时间延长,表达量逐渐增加,而总的P53蛋白表达没有明显变化。10μM甲醛刺激细胞,与对照组相比,在1、3和24小时各时间点γ-H2AX蛋白表达均没有改变。我们采用特异化学抑制剂和RNA干扰技术检测PARP-1在甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用,用PARP-1的特异化学抑制剂,PJ34,抑制PARP-1后,DNA损伤修复试验发现,甲醛刺激细胞4h后,换新鲜培养基继续培养2h,与HBE组相比,甲醛诱导的彗星尾部DNA百分含量显著增高,撤除甲醛再培养2h后甲醛诱导的DNA损伤没有完全修复,DNA损伤修复率为73.47%。进一步,为检测ATM在甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用,采用RNA干扰技术抑制ATM,结果显示抑制ATM后,可部分的抑制磷酸化P53的表达。彗星试验结果显示,抑制ATM后,甲醛诱导的DNA损伤程度没有明显改变,表现为彗星尾部DNA百分含量与对照组相比没有显著差异。抑制ATM后,甲醛诱导的DNA损伤修复率也没有明显改变。进一步的细胞周期检测结果显示,10μM甲醛刺激细胞24h后,S期细胞比例显著增加。抑制ATM后,S期细胞比例的增加没有明显差异,但是G2/M期细胞比例显著增加。RNA干扰技术抑制PARP-1后,甲醛诱导的磷酸化JNK和P53高表达明显受到抑制,而磷酸化ERK的表达没有受到明显影响。抑制JNK和ERK均可以显著降低甲醛诱导的PARP-1和XRCC-1蛋白的高表达。抑制JNK还可以显著减弱甲醛诱导的磷酸化P53的高表达,而抑制ERK没有影响甲醛诱导的磷酸化P53的高表达。采用免疫共沉淀技术检测PARP-1与XRCC-1蛋白的结合情况,甲醛可以诱导PARP-1与XRCC-1蛋白结合增加,抑制JNK后,这种结合显著减低,而抑制ERK没有影响二种蛋白的结合。进一步验证PARP-1信号通路在甲醛诱导的免疫反应中的作用。用10μM甲醛刺激16HBE细胞,在不同时间点分别检测NF-κB的表达,结果发现,总P65蛋白表达在各时间点均没有明显改变。10μM甲醛刺激16HBE细胞24h,检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果发现,IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的本底表达非常低。与对照组相比,IL-6和IL-8的表达水平在10μM甲醛刺激的16HBE细胞明显增高,抑制了PARP-1后显著的阻滞了甲醛诱导的IL-6和IL-8的表达水平增高。10μM甲醛刺激16HBE细胞2个小时,检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平。结果发现10μM甲醛可以诱导活性氧增加,抑制PARP-1后,活性氧水平有所减低,但是差异不显著。提示10μM甲醛诱导的活性氧的增加是由多途径调控的。为了进一步验证甲基化酶和PARP-1通路在10μM甲醛诱导的甲基化改变中的作用,首先检测了甲基化酶表达情况,10μM甲醛暴露可以诱导DNMT-1蛋白表达显著增加。采用免疫共沉淀方法检测PARP-1与DNMT-1蛋白之间结合情况,甲醛可以诱导PARP-1和DNMT-1蛋白之间的结合增加。PARP-1基因启动子区甲基化检测结果显示,本研究所选的各CPG位点甲基化水平并没有随着低浓度甲醛的刺激而发生改变。结论与讨论：甲醛暴露可引起工人外周血淋巴细胞遗传损伤。PARP-1在DNA损伤早期修复中起重要作用,工人长期反复接触甲醛,当DNA损伤比较严重时,PARP-1过多的表达将会反向调节PARP-1自身,DNA修复效能进一步下降,如此恶性循环,导致遗传损伤在外周血淋巴细胞中累计,表现为外周血淋巴细胞彗星TDNA%和微核率均明显增高。此外,当机体的损伤程度超过了机体自身修复能力时,机体会通过自动关闭PARP-1等DNA损伤修复基因,引起PARP-1等基因表达沉默并使其功能丧失,增加机体的容错能力,加重了机体遗传损伤的程度。长期甲醛暴露还可引起工人外周血主要淋巴细胞亚群相对百分含量的改变,细胞因子表现为Th2型优势状态,而Th2细胞因子优势状态与哮喘及肿瘤的免疫逃逸有密切关系,所以对甲醛暴露工人外周血细胞因子的监测有助于了解甲醛暴露工人机体的细胞免疫和体液免疫状态,为职业暴露高危人群的健康保护提供依据。本研究体外实验采用16HBE细胞对PARP-1通路在甲醛诱导的遗传损伤修复中的作用进行了验证。本研究结果提示,在低浓度甲醛暴露的早期,PARP-1通路不仅是DNA损伤修复所必须的重要蛋白,同时它也参与了炎症反应的调控。综合本研究的体内和体外实验结果我们推断,短期和长期甲醛暴露均可以诱导不同类型的遗传损伤和免疫指标改变,不同的甲醛暴露剂量、时间、试验对象以及试验条件都将产生不同的效应。