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背景和目的：各种不同病因的慢性肾脏病的发展最终均以渐进性的肾小管间质纤维化和肾功能衰竭为基本特征，肾小管间质纤维化为其最后的共同病理学改变，表现为肾间质成纤维细胞的增生及细胞外基质的沉积。研究证明，肾小管上皮细胞-间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在肾小管间质纤维化过程中发挥重要的作用，EMT是指在肾小管上皮细胞在病理因素的刺激下，失去上皮细胞的特征，表现为肌成纤维细胞特性。Wnt信号通路是一条在生物进化中极为保守的通路，在细胞的黏附、迁移、上皮间质转化、生长、分化、凋亡以及在胚胎发育、器官发生和维持组织器官内环境稳定等过程中具有重要作用。最近研究发现，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白在肾间质纤维化动物模型中表达升高，但Wnt/β-catenin信号通路在肾小管间质纤维化中的作用机制仍不清楚。本研究体外培养人近端肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells，HKCs)，采用Wnt阻滞剂Dickkopf-1(Dkk-1)及构建的β-catenin短发卡干扰RNA(shorthairpin RNA，shRNA)从两个水平上阻断Wnt/β-catenin信号通路，观察其对肾小管上皮细胞EMT的影响，探讨其在肾间质纤维化发生发展中的作用，以期为抗肾小管间质纤维化治疗寻找新的干预靶点提供理论依据。方法：1.将体外培养的HKC细胞分为对照组、TGF-β1组(TGF-β1终浓度为20ng/ml)和TGF-β1+Dkk-1组(TGF-β1、Dkk-1终浓度分别为20ng/ml、100ng/ml)，培养48小时后RT-PCR及Western blot检测细胞Wnt4、β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表达，细胞免疫荧光染色观察E-cadherin和α-SMA的表达。2.根据shRNA设计原则，设计针对β-catenin基因的3个干扰靶点，合成序列片段，构建β-catenin-shRNA干扰质粒，经鉴定片段成功插入后，以LipofectamineTM2000将空白质粒、重组的三个干扰质粒转染TGF-β1(终浓度为20ng/ml)诱导的HKC细胞，48小时后检测转染效率，RT-PCR及Western blot检测各组细胞β-catenin的mRNA及蛋白表达，挑选对β-catenin基因抑制效果最好的β-catenin-shRNA干扰质粒。3.将HKC细胞分4组：①对照组，含10%FBS的DMEM/F12培养基培养；②TGF-β1组，在常规培养基中加入TGF-β1(浓度为20ng/ml)；③TGF-β1+转染空白质粒组，在常规培养基中加入TGF-β1(浓度为20ng/ml)，该组转染空白对照质粒；④TGF-β1+转染干扰质粒组，在常规培养基中加入TGF-β1(浓度为20ng/ml)，该组转染干扰质粒；各组细胞按照分组处理或以LipofectamineTM2000转染不同质粒，培养48h后在倒置相差显微镜观察细胞形态，RT-PCR及Western blot检测细胞β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表达，细胞免疫荧光染色观察E-cadherin和α-SMA的表达。结果：1. Wnt阻滞剂Dickkopf-1(Dkk-1)对HKC细胞转分化的作用Wnt4在对照组几乎没有表达，在TGF-β1组和TGF-β1+Dkk-1组显著上调；β-catenin的mRNA在对照组、TGF-β1组和TGF-β1+Dkk-1组均有较高的表达，组间没有明显差异，β-catenin的蛋白在对照组低水平表达，在TGF-β1组明显上调，在TGF-β1+Dkk-1组表达显著下调；E-cadherin的在对照组高表达，在TGF-β1组表达显著降低，在TGF-β1+Dkk-1组表达明显上调；α-SMA的表达与E-cadherin的表达相反，在对照组表达很低，在TGF-β1组表达显著上调，在TGF-β1+Dkk-1组表达较TGF-β1组明显下调。细胞免疫荧光结果显示，E-cadherin在对照组高表达，呈现明亮的绿色荧光，在TGF-β1组表达降低绿色荧光表达减弱，在TGF-β1+Dkk-1组的表达较TGF-β1组明显表达升高，绿色荧光较TGF-β1组增强；α-SMA的红色荧光表达完全同E-cadherin相反。2.β-catenin-shRNA干扰质粒的构建及筛选构建的β-catenin-shRNA干扰质粒经酶切鉴定及测序鉴定证实设计片段完全插入；按照LipofectamineTM2000说明转染的空白质粒及干扰质粒，通过荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率为60%左右，组间没有明显差异，达到实验要求；RT-PCR及Westernblot结果显示，3个转染β-catenin-shRNA干扰质粒组β-catenin的mRNA及蛋白表达较转染空白质粒组均显著降低，其中β-catenin-shRNA-1干扰质粒对β-catenin的抑制效果最佳。3. shRNA干扰β-catenin对HKC细胞转分化的作用β-catenin的mRNA在对照组、TGF-β1组及转染空白质粒组均高表达，组间无差异，在转染干扰质粒组表达显著降低。总蛋白β-catenin在对照有较低水平表达，胞核无β-catenin表达，总蛋白β-catenin在TGF-β1组表达显著升高，胞核β-catenin也有较高表达，在转染空白质粒组，总蛋白β-catenin及胞核β-catenin表达同TGF-β1组高表达，在转染干扰质粒组，总蛋白β-catenin表达明显下降，胞核无β-catenin表达E-cadherin的mRNA在对照组高表达，在TGF-β1组表达显著下降，在转染空白质粒组，同TGF-β1组一致表达显著下降，在转染干扰质粒组其表达显著上升；α-SMA的mRNA在对照组几乎没有表达，在TGF-β1组表达明显升高，转染空白质粒组α-SMA的mRNA表达同TGF-β1组一致表达明显升高，在转染干扰质粒组，α-SMA的mRNA显著下降。细胞免疫荧光显示，E-cadherin在对照组为明亮的绿色荧光，在TGF-β1组绿色荧光表达减弱，转染空白质粒组表达同TGF-β1组，绿色荧光表达减弱，在转染干扰质粒组，绿色荧光较TGF-β1组及转染空白质粒组显著增强；α-SMA的红色荧光表达完全同E-cadherin相反。结论：1. Wnt/β-catenin信号通路参与HKC细胞转分化，Wnt阻滞剂Dkk-1可以抑制其转分化；2.构建的β-catenin-shRNA干扰质粒成功转染HKC细胞，可以有效抑制β-catenin的表达；3. shRNA干扰β-catenin可以通过下调β-catenin的表达抑制HKC细胞转分化。