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目的:分析miR-20b-5p在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染的巨噬细胞内的表达,以及miR-20b-5p在Mtb感染的巨噬细胞源性外泌体中的表达。探讨miR-20b-5p对巨噬细胞内Mtb的影响及可能机制。方法:以感染复数(MOI)=10的Mtb感染细胞,通过RT-PCR检测miR-20b-5p在Mtb感染RAW 264.7巨噬细胞后6 h、16 h、24 h和36 h的表达。超速离心法提取细胞培养液上清中的外泌体,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)鉴定外泌体的形态特征,Western blot检测外泌体标志性蛋白CD63。RT-PCR检测miR-20b-5p在Mtb感染的巨噬细胞源性外泌体中的表达。通过转染miR-20b-5p mimics和miR-20b-5p inhibitor上调和下调RAW 264.7巨噬细胞内miR-20b-5p的表达,24 h后以MOI=10的Mtb感染细胞,一方面,通过将感染的巨噬细胞裂解,释放的Mtb接种于罗氏培养上,培养28 d,通过计数菌落数检测调控miR-20b-5p对Mtb生存的影响。另一方面,用CCK-8试剂盒检测其在6 h、16 h、24 h和36 h对巨噬细胞活性的影响,用AO/EB染色法及TEM检测感染24 h后其对细胞凋亡的影响。用Miranda、TargetScan、PicTar软件预测miR-20b-5p可能靶向的基因,取三个数据库的交集。利用Cytoscape中的BiNGO插件对靶基因集合的分子功能、生物学过程、细胞组分进行分析。提交miR-20b-5p的靶基因至DAVID数据库,利用其中的Functional Annotation软件,选择KEGG通路分析。选取miR-20b-5p可能靶向调控的凋亡相关基因Mcl-1,利用TargetScan对靶基因Mcl-1与miR-20b-5p配对分析。通过RT-PCR检测调控miR-20b-5p对其可能靶向的基因Mcl-1表达的影响。结果:(1)PCR结果显示,与正常对照组(0.977±0.006)比较,感染组6 h(0.870±0.026)(t=0.552,P<0.001),16 h(0.727±0.021)(t=1.294,P<0.001),24 h(0.643±0.031)(t=1.725,P<0.001)和36 h(0.520±0.026)(t=2.364,P<0.001)miR-20b-5p表达量均降低,且具时间依赖性。(2)外泌体RNA琼脂糖凝胶电泳结果,只可见一条小RNA电泳条带,其中28S和18S核糖体RNA条带未出现。PCR结果显示,在正常RAW 264.7巨噬细胞源性外泌体中未得到miR-20b-5p的扩增产物,而在Mtb感染的RAW 264.7巨噬细胞源性外泌体中可扩增出miR-20b-5p条带。(3)Mtb罗氏培养结果显示,miR-20b-5p mimics组(0.67±0.01)与上调对照组(2.33±0.58)相比,菌落形成单位(Colony forming unit,CFU)计数减少(t=5.000,P<0.05)。miR-20b-5p inhibitor组(4.33±0.58)与下调对照组(2.67±0.58)相比,CFU计数增多(t=5.000,P<0.05)。(4)酶标仪检测CCK-8结果显示,在感染后6 h,与上调对照组(56.46±1.88%)相比,miR-20b-5p mimics组(44.39±1.31%)细胞活力降低(t=6.672,P<0.05);与下调对照组(54.87±0.733%)相比,miR-20b-5p inhibitor组(64.76±2.79%)细胞活力升高(t=5.082,P<0.05)。在感染后16 h,与上调对照组(66.15±3.05%)相比,miR-20b-5p mimics组(39.30±0.79%)细胞活力降低(t=19.263,P<0.01);与下调对照组(66.96±2.48%)相比,miR-20b-5p inhibitor组(72.88±1.19%)细胞活力差异无统计学意义(t=3.023,P>0.05)。在感染后24 h,与上调对照组(75.62±3.25%)相比,miR-20b-5p mimics组(35.07±3.28%)细胞活力降低(t=21.738,P<0.01);与下调对照组(72.56±2.07%)相比,miR-20b-5p inhibitor组(97.14±1.63%)细胞活力升高(t=11.600,P<0.01)。在感染后36 h,与上调对照组(74.73±4.41%)相比,miR-20b-5p mimics组(27.22±0.30%)细胞活力降低(t=17.678,P<0.01);与下调对照组(74.12±2.07%)相比,miR-20b-5p inhibitor组(88.55±0.98%)细胞活力升高(t=10.680,P<0.01)。经AO/EB染色,荧光显微镜下显示,上调对照组与下调对照组细胞染色均呈现绿色荧光,细胞核呈现密度较均匀的黄绿色荧光。miR-20b-5p mimics组细胞染色呈现黄绿色荧光,细胞核染色质部分呈现强烈的橘红色荧光,形状固缩变圆。miR-20b-5p inhibitor组细胞呈现绿色或暗绿色荧光,几乎均匀分布于整个细胞。与上调对照组(28.11±6.49%)相比,miR-20b-5p mimics组(66.36±4.68%)细胞凋亡指数升高(t=10.643,P<0.01),与下调对照组(25.08±2.40%)相比,miR-20b-5p inhibitor组(16.73±2.25%)细胞凋亡指数降低(t=5.362,P<0.05)。TEM结果显示,正常对照组细胞结构完整,细胞核边缘整齐,线粒体清楚。感染对照组细胞可见细胞核染色质部分边缘聚集,线粒体嵴模糊、断裂。miR-20b-5p mimics组细胞伪足消失,胞膜皱缩,细胞体积变小,细胞核碎裂消失,可见膜包裹细胞核碎片的凋亡小体,线粒体发生肿大、空泡化样改变,胞质内粗面内质网(Rough endoplasmic reticulum,RER)出现扩张。上调对照组细胞可见细胞核染色质浓缩,呈现“黑洞”状,线粒体嵴模糊、断裂、空泡样改变,胞浆内可见自噬小体。miR-20b-5p inhibitor组细胞与下调对照组细胞对比,形态结构区别不大,可见完整的细胞膜,细胞核边缘整齐,大多数线粒体清楚,可见几个空泡化的线粒体。(5)miR-20b-5p靶基因预测得到171个靶基因。分子功能分析结果显示,miR-20b-5p靶基因主要富集于蛋白结合、转录调控活性、DNA结合等方面。生物学过程分析结果显示,miR-20b-5p靶基因主要富集于胞内大分子代谢过程、蛋白修饰过程、调控基因表达、细胞凋亡等过程。细胞组分分析结果显示,miR-20b-5p靶基因主要参与细胞组分、细胞器组分、囊泡等。KEGG通路富集分析显示,显著富集于MAPK信号通路、前列腺癌信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、p53信号通路、T细胞受体信号等通路。靶基因Mcl-1与miR-20b-5p配对分析发现,凋亡相关基因Mcl-1与miR-20b-5p种子区域的配对类型为8mer,并且Mcl-1与miR-20b-5p非种子区域3’端存在互补特征。(6)PCR结果显示,与上调对照组(0.850±0.017)比较,miR-20b-5p mimics组(0.657±0.025)Mcl-1 mRNA表达量降低(t=21.922,P<0.01)。与下调对照组(0.853±0.029)比较,miR-20b-5p inhibitor组(1.103±0.075)Mcl-1 mRNA表达量升高(t=8.183,P<0.05)。结论:(1)miR-20b-5p在Mtb感染的RAW 264.7巨噬细胞中表达降低,且具时间依赖性。(2)Mtb感染RAW 264.7巨噬细胞后,miR-20b-5p可被分选装配入外泌体中。(3)miR-20b-5p负性调控巨噬细胞内Mtb存活的可能机制是,通过促进抗凋亡基因Mcl-1的表达,从而抑制细胞凋亡。