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目的细胞色素氧化酶P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)参与生物体内许多内源性和外源性物的代谢,如乙醇、四氯化碳、丙酮和花生四烯酸等。CYP2E1主要主要分布在肝脏,在脑、肺、胃、肠、心脏等也有高表达。CYP2E1参与脂质过氧化、细胞凋亡等过程,与脂肪性肝病、糖尿病及肿瘤等疾病相关。目前,关于CYP2E1在心脏中的作用以及与心肌病的关系研究未见报道。因此本实验构建了心脏特异的CYP2E1转基因小鼠,用于分析CYP2E1基因在心脏发育过程中的作用以及对cTnTR141W转基因扩张型心肌病(DCM)及cTnTR92Q转基因肥厚型心肌病(HCM)小鼠的调节作用。方法cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和∏western blot检测CYP2E1于扩张型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表达变化。Western blot检测CYP2E1于野生型C57BL/6J小鼠中的时程表达变化。PCR扩增小鼠CYP2E1的cDNA序列,并将其插入α-MHC启动子下游,构建心脏特异转基因表达载体,通过显微注射法建立CYP2E1转基因C57BL/6J小鼠,并分别与cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠杂交获得双转基因小鼠。M型超声心动图检测CYP2E1×cTnTR141w、CYP2E1×cTnTR141w、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏的结构形态和功能变化,并记录其生存状况。病理组织学染色观察CYP2E1、cTnTR141w、CYP2E1×cTnTR14W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏组织学改变。分光光度法检测CYP2E1、cTnTR141w, CYP2E1×cTnTR141w、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏H2O2、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)及总抗氧化能力(T-AOC)变化。透射电镜观察CYP2E1转基因小鼠心脏超微结构改变。逆转录PCR及和western blot检测CYP2E1转基因小鼠心肌肥厚分子(?)narker表达变化。Western blot检测CYP2E1转基因小鼠心脏信号分子的变化。结果cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和(?)vestern blot结果显示,CYP2E1于肥厚型心肌病模型小鼠心肌中的表达上调,于扩张型心肌病模型小鼠心肌中的表达下调。CYP2E1在野生型C57BL/6J小鼠胚胎期心脏中未见表达,出生后一至二周表达最高,之后随着年龄增长表达下调。建立了心脏组织特异的CYP2E1高表达转基因小鼠,同时建立了心脏组织特异的CYP2E1×cTnTR141W及CYP2E1×cTnTR92C两种杂交小鼠。M型超声心动图结果表明CYP2E1的过表达：使野生型小鼠发生DCM表型,即心腔扩大,心壁变薄,心功能下降；使cTnTR141W转基因小鼠心脏的DCM表型更加严重；使cTnTR92Q转基因小鼠心脏向心衰发展,即心脏出现失代偿性的心室腔变大,室壁变薄,心功能下降。心脏组织学显示,CYP2E1的过表达加重野生型小鼠、cTnTR141w和cTnaTR92Q转基因小鼠的心肌排列紊乱、肥大及间质纤维化程度。至5月龄,CYP2E1转基因小鼠死亡率为8%；cTnTR141W转基因小鼠死亡率为16%；CYP2E1xcTnTR141w转基因小鼠死亡率为48%；cTnTR92Q转基因小鼠死亡率为4%；CYP2ElxcTnTR92Q转基因小鼠死亡率为20%。电镜检测显示CYP2E1转基因小鼠心脏肌纤维粗细不均一,肌浆网扩张,溶酶体增多,线粒体肿胀并伴有脊断裂。RT-PCR及western blot结果表明CYP2E1转基因小鼠心脏心肌细胞肥大分子标志物,包括肌小节蛋白基因Myot、Cnnl,细胞骨架蛋白基因Acta1,细胞外基质基因Collal、Co13al,信号传导相关基因Nppa及Nppb均表达增加。分光光度法检查结果表明CYP2E1的过表达可增加野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q转基因小鼠心脏中H2O2和MDA含量,降低GSH和T-AOC。而CYP2E1转基因小鼠心脏中ERK1/2、JNK、P38、P13K、Akt、GSK3β(?)言号分子的总蛋白形式及磷酸化形式未发生改变。结论通过对CYP2E1转基因小鼠的研究,我们首次发现CYP2E1可以使小鼠心脏发生DCM表型,且CYP2E1可加重cTnTR141W小鼠的DCM病理表型,使cTnTR92Q小鼠的HCM病理表型向心衰转变。而CYP2E1介导的氧化应激很可能参与到这一病理重塑过程中。目的半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase, CDO1)作为体内半胱氨酸代谢酶,主要分布在肝脏,在肾、肺和心脏等组织也有高表达,而CDO1在心脏中的作用以及与心血管疾病的关系研究未见报道,因此本实验建立心脏特异表达CDO1转基因小鼠,用于研究该基因在心脏发育中的作用及与心血管疾病特别是心肌病关系。方法cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和westernblot检测CDO1于扩张型心肌病(DCM)及肥厚型心肌病(HCM)模型小鼠中的表达变化。Western blot检测小鼠心脏CDO1表达谱。PCR扩增人CDO1的cDNA序列,并将其插入α-MHC启动子下游,构建心脏特异转基因表达载体,通过显微注射法建立CDO1转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型。结果cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和westernblot结果显示,CDO1于肥厚型心肌病模型小鼠心肌中的表达上调,于扩张型心心肌病模型小鼠心肌中的表达下调。通过转基因小鼠的筛选,得到了2个心脏CDO1蛋白高表达的转基因系。单转CDO1基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化。结论成功建立了心脏特异表达CDO1转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western blotting方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western blotting发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。