目的:前期采用蛋白质组学技术,研究重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者与正常人髓样树突状细胞(m DC)和骨髓CD34+细胞的差异蛋白质成份,初步筛选有同源性的差异蛋白质,即激活SAA免疫反应可能的抗原物质,研究SAA患者m DC及CD34+细胞内差异蛋白质表达水平,与患者临床资料的相关性,及其对m DC、效应T细胞及靶细胞的影响,探讨此差异蛋白质调控SAA自身免疫状态的机制及其在SAA发病中的作用,为进一步阐明SAA免疫发病机制提供理论依据。构建免疫介导骨髓衰竭小鼠模型,评价模型的免疫状态,通过SAA小鼠模型分析差异蛋白质在小鼠体内表达水平,为后续探索SAA免疫发病的始动因素、指导免疫抑制剂的临床应用、减少病情复发,提供实验依据。方法:选取天津医科大学总医院血液科,自2014年4月至2017年4月收治的未经治疗的初治SAA患者(初诊组)、经免疫抑制治疗后缓解的SAA患者(恢复组)及正常对照者作为研究对象。C57BL/6小鼠,BALB/c小鼠,CBy B6F1小鼠,饲养于中国医学科学院放射医学研究所的动物实验中心,SPF级动物房。第一部分:初步探索致SAA免疫激活成因的靶抗原物质。课题组前期,采用体外诱导培养将SAA患者及正常人的单核细胞,分化为成熟的m DC,流式细胞仪分选得到高纯度m DC,提取总蛋白,进行双向电泳分离蛋白质,取差异蛋白质点进行比对,明确SAA患者m DC内与正常人不同的蛋白质成分。应用免疫磁珠法分选SAA患者及正常人骨髓CD34+细胞,提取总蛋白,将蛋白质酶解,应用i TRAQ标记样品,应用多维液相色谱分离样品并串联质谱Q Exactive进行蛋白质分析,应用数据库检索鉴定蛋白质,并比较这些蛋白质的表达差异。本部分对SAA患者与健康人m DC与CD34+细胞蛋白质组学中筛选出的差异蛋白质进行同源性比对,明确SAA患者m DC与CD34+细胞内差异蛋白质成分有无同源性或交叉性,即导致SAA发病可能的抗原物质。第二部分:检测筛选出的差异蛋白质成分在SAA及正常人体内的表达。选取26例SAA初治患者、22例SAA恢复期患者及18名健康正常人,采用流式细胞术(FCM)检测SAA患者m DC与CD34+细胞内同源性差异蛋白质成分白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin like receptors,LILRs)A亚型在m DC细胞、CD34+细胞、CD3+CD8+等多种细胞内表达;实时定量RT-PCR技术检测骨髓单个核细胞(BMMNC)、m DC细胞、CD34+细胞内其mRNA相对表达水平;使用免疫印迹法(Western Blot)检测SAA患者LILRA表达。同期检测上述SAA患者m DC细胞数量,增殖、活化因子表达;CD34+细胞数量,凋亡、细胞因子表达;CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Th1/Th2比例、CTL细胞数量,功能、细胞因子表达;分析其与上述检测结果及SAA患者病情进行相关性分析。第三部分:体外细胞模型验证筛选出的差异蛋白质成分LILRA对m DC的激活作用,并验证骨髓靶细胞内表达筛选出的差异蛋白质成分而受到CTL攻击。应用RNAi敲除差异蛋白质成分,分选SAA患者及正常健康人的CD11C+HLA-DR+细胞作为m DC细胞,分选CD8+MHC-I+T细胞作为效应CTL细胞,分选CD34+细胞或阴性分选去除CD3+T细胞后作为靶细胞;体外将m DC细胞与CTL细胞混合培养,检测基因表达减低前后m DC细胞抗原递呈功能变化,m DC细胞对CTL激活的作用;体外将CTL细胞与靶细胞混合培养,检测基因表达减低前后CTL对造血靶细胞的凋亡作用。第四部分:初步建立免疫介导的骨髓衰竭小鼠模型。模型小鼠经非致死剂量照射后,其造血干细胞和骨髓微环境损伤严重,当输入次要组织相容性抗原不合的小鼠淋巴结细胞后,可进一步诱导免疫性骨髓造血功能损伤的模型。检测血细胞计数、骨髓细胞计数及形态;骨髓细胞培养克隆形成实验,脾脏、肝脏和骨髓组织病理;流式细胞术检测骨髓LSK及人LILRs在鼠类的同源物成对的免疫球蛋白样受体(paired immunoglobulin-like receptors,PIRs)的表达。结果:第一部分:课题组前期鉴定SAA患者与健康正常人m DC细胞蛋白成分的差异表达,其中20个在初诊组上调,21个在初诊组下调。课题组前期明确SAA患者与健康正常人CD34+细胞蛋白成分的差异表达,其中54个在初诊组上调,103个在初诊组下调。我们对在初诊组表达上调的差异蛋白分别进行同源性或交叉性对比。我们发现与正常人的m DC细胞相比,SAA患者m DC细胞内白细胞免疫球蛋白样受体A3(leukocyte immunoglobulin like receptor A3,LILRA3)表达增高;与正常人的CD34+细胞相比,SAA患者CD34+细胞内白细胞免疫球蛋白样受体A5(LILRA5)表达增高;经BLAST序列比对及文献结构分析显示LILRA3与LILRA5胞外结构域的氨基酸序列高度同源,具有高结构同源性,并与相同的MHC-I配体结合。实时定量PCR技术检测其BMMNC LILRA(1-6)mRNA相对表达水平,SAA初诊组LILRA3 mRNA相对表达水平(3.51±3.29)明显高于正常对照组(1.37±0.96)(P<0.05),恢复组(2.45±1.77)明显高于正常对照组(P<0.05),初诊组和恢复组比较差异无统计学意义,SAA组LILRA5mRNA相对表达水平较正常对照组有升高趋势,但差异无统计学意义。第二部分:检测LILRA在SAA及正常人体内的表达。流式细胞术检测SAA初诊组骨髓LILRA3+/CD34+比例[(47.05±32.07)%]明显高于正常对照组[(14.26±14.00)%](P<0.05),恢复组[(39.86±19.46)%]高于正常对照组(P<0.05)。SAA初诊组骨髓LILRA3+/CD11C+HLA-DR+比例[(73.11±22.54)%]明显高于正常对照组[(48.64±38.03)%](P<0.05),恢复组[(60.22±23.69)%]和正常对照组比较差异无统计学意义。q RT-PCR技术检测m DC细胞内LILRA3 mRNA相对表达水平,初诊SAA患者m DC细胞内LILRA3 mRNA相对表达水平(1.79±1.30)明显高于正常对照组(0.77±0.72)(P<0.05),初诊组和恢复组(1.47±0.99)、恢复组和正常对照组比较差异无统计学意义。Western Blot显示初诊组患者m DC细胞内LILRA3蛋白水平明显升高。SAA组骨髓LILRA3+/CD34+比例与血小板数量呈负相关(r=-0.497,P<0.05),与血红蛋白数量呈负相关(r=-0.427,P<0.05),SAA组骨髓LILRA3+/CD34+比例与LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例呈正相关(r=0.330,P<0.05),LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例与LILRA3 mRNA表达水平呈正相关(r=0.344,P<0.05)。第三部分:体外细胞模型分选m DC细胞,CD8+T细胞,CD34+细胞及阴性分选CD3-T细胞;检测LILRA3的配体HLA-A/B/C在CD8+T细胞上的表达,结果显示HLA-A/B/C+/CD3+CD8+比例在SAA初诊组、恢复组和正常对照组比较均无显著性差异;敲低m DC和靶细胞LILRA3表达后,我们分别检测了混合培养后CTL的功能效应分子CD178(Fas L)的表达,以及CD34+细胞凋亡分子CD95(Fas)的表达,结果示初诊SAA患者(组1)CD178+/CD3+CD8+的比例[(14.22±6.74)%]明显高于(组2)初诊SAA患者m DC细胞与正常对照者CTL混合培养组[(4.53±1.73)%]和(组3)初诊SAA患者LILRA3表达减低的m DC细胞与正常对照者CTL混合培养组[(4.67±1.60)%](P<0.05),组2和组3比较差异无统计学意义(P>0.05)。初诊SAA患者(组1)CD95+/CD34+的比例[(78.24±27.60)%],初诊SAA患者CD34+/靶细胞与正常对照者CTL混合培养组(组2)[(62.24±16.18)%],初诊SAA患者LILRA3表达减低的CD34+/靶细胞与正常对照者CTL混合培养组(组3)[(46.59±26.00)%],三组比较均无显著性差异(P>0.05)。初诊SAA患者(组1)靶细胞凋亡率为[(39.86±15.91)%],初诊SAA患者CD34+/靶细胞与正常对照者CTL混合培养组(组2)[(35.03±21.09)%],初诊SAA患者LILRA3表达减低的CD34+/靶细胞与正常对照者CTL混合培养组(组3)[(36.03±22.09)%],三组比较均无显著性差异(P>0.05)。初诊SAA患者(组1)CTL细胞活性为[(2.27±1.76)%]明显高于初诊SAA患者LILRA3表达减低的m DC细胞与正常对照者CTL混合培养组(组3)[(1.39±0.25)%](P<0.05),初诊SAA患者m DC细胞与正常对照者CTL混合培养组(组2)[(2.87±1.06)%]和其它两组比较均无显著性差异(P>0.05)。第四部分:初步建立免疫介导的骨髓衰竭小鼠模型。实验组小鼠先接受5.0-6.0 Gy的Cesium-137γ射线(剂量率1.0 Gy/min)全身照射后,4-6小时内将C57BL/6(H2b/b)小鼠淋巴细胞悬液(5-10×106个细胞)通过眼眶静脉注射到CBy B6F1(H2b/d)小鼠体内,于注射C57BL/6小鼠淋巴细胞后第14天采集外周血,结果显示实验组小鼠外周全血细胞减少率为100%,死亡率15%,小鼠重度全血细胞减少,网织红细胞和中性粒细胞绝对值减少,均明显低于正常对照组和TBI照射组,组织活检示骨髓增生显著减低,有效造血容积15-20%,粒红系显著减低,全片未见巨核细胞。实验组小鼠骨髓细胞计数明显低于TBI照射组和正常对照组,CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM各集落形成单位计数明显低于TBI照射组和正常对照组,HPC和HSC计数明显低于TBI照射组和正常对照组,实验组小鼠符合AA动物模型的判断标准。FCM检测实验组PIR-A/B+/CD34+比例[(42.41±9.97)%],TBI照射组[(42.00±12.50)%]和正常对照组[(48.08±7.58)%]三组比较差异无统计学意义(P>0.05),实验组PIR-A/B+CD8+/CD3+比例[(2.89±1.57)%]明显低于TBI照射组[(19.63±12.50)%]和正常对照组[(23.77±10.58)%](P<0.05)。实验组PIR-A/B+/CD11c+比例[(50.08±20.65)%]明显低于正常对照组[(72.03±17.55)%](P<0.05),TBI照射组[(58.62±7.42)%]明显低于正常对照组(P<0.05)。结论:(1)经BLAST序列比对及文献结构分析显示SAA患者mDC细胞内表达增高的LILRA3与SAA患者CD34+细胞内表达增高的LILRA5胞外结构域的氨基酸序列高度同源,具有高结构同源性。(2)进一步验证显示LILRA3在SAA患者m DC细胞和CD34+细胞内基因水平或是蛋白水平均表达明显增高。LILRA3+/CD34+比例与LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例呈正相关,LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例与LILRA3mRNA表达水平呈正相关,LILRA3+/CD34+比例与血小板数量呈负相关,与血红蛋白数量呈负相关,并且与疾病进程呈现相关性。(3)SAA患者m DC细胞内升高的LILRA3参与了m DC细胞活化过程,刺激CTL功能分子表达水平升高,功能亢进;而骨髓靶细胞内表达升高的LILRA3可使CTL增强对靶细胞的杀伤作用。(4)成功建立SAA小鼠模型,并通过SAA小鼠模型分析PIR-A/B表达水平。SAA患者LILRA3表达异常,数量增加,功能亢进,且表达水平与免疫功能状态的变化具有一致性,随着治疗有效,逐渐趋于正常。LILRA3在SAA免疫发病机制中发挥重要作用,LILRA3有可能成为该疾病潜在的治疗靶点。