论文部分内容阅读
目的:通过对体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞进行氧糖剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/Restoration,OGD/R)以模拟大鼠脊髓星形胶质细胞损伤状态。观察损伤后高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达情况以及正常大鼠脊髓星形胶质细胞转化为A1型和A2型反应性星形胶质细胞的情况,探讨HMGB1对经过OGD/R模型损伤后的大鼠脊髓星形胶质细胞亚型变化的调节作用及其作用机制。方法:第一部分,观察体外氧糖剥夺/复氧复糖损伤处理后活化的反应性星形胶质细胞向A1和A2型反应性星形胶质细胞亚型的转化情况。培养取自1-2内新生的SD大鼠的乳鼠的脊髓星形胶质细胞,建立氧糖剥夺/复氧复糖模型。实验共有四组:正常组(正常培养的大鼠脊髓星形胶质细胞,不做特殊处理),OGD6h/R6h(氧糖剥夺6小时/复氧复糖6小时的大鼠脊髓星形胶质细胞细胞),OGD6h/R12h(氧糖剥夺6小时/复氧复糖12小时的大鼠脊髓星形胶质细胞细胞),OGD6h/R24h(氧糖剥夺6小时/复氧复糖24小时的大鼠脊髓星形胶质细胞细胞)。酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测上述四组细胞培养基内(即细胞外的)HMGB1含量。接下来,采取蛋白免疫印迹技术检测上述四组细胞中A1型星形胶质细胞标记蛋白C3和A2型星形胶质细胞标记蛋白S100A10的表达情况。第二部分,观察抑制HMGB1后,反应性星形胶质细胞亚型转换情况及其功能变化。通过第一部分实验找出A1型星形胶质细胞表达最多的时间点。通过转染携带HMGB1沉默基因的慢病毒干扰细胞合规部蛋白的表达,通过丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)抑制HMGB1的表达。实验分为五组进行:正常组,模型组(氧糖剥夺/再灌注组),HMGB1干扰组(携带HMGB1沉默基因的慢病毒与正常星形胶质细胞共同培养后进行氧糖剥夺),阴性序列转染组(将携带对HMGB1基因没有影响的慢病毒与正常星形胶质细胞共同培养后进行氧糖剥夺),HMGB1+EP组(氧糖剥夺/再灌注+EP)。酶联免疫吸附试验检测各组细胞培养基中HMGB1,谷氨酸,IL-1β,TNF-α含量,通过Western Blot法检测上述四组细胞中A1型星形胶质细胞标记蛋白C3和A2型星形胶质细胞标记蛋白S100A10以及HMGB1蛋白的表达含量。第三部分,观察HMGB1通过Toll样受体4(TLR4)/核转录因子Κb(NF-κB)通路对大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后亚型的调节作用。实验分为五组进行:正常组,模型组,HMGB1抑制剂组,TLR4抑制剂组,NF-Κb抑制剂组。酶联免疫吸附试验检测各组细胞培养基中HMGB1,谷氨酸,IL-1β,TNF-α含量,通过Western Blot法检测上述五组细胞中A1型星形胶质细胞标记蛋白C3和A2型星形胶质细胞标记蛋白S100A10以及TLR4和NF-Κb蛋白的表达含量。结果:1.在第一部分实验中:观察体外氧糖剥夺/复氧复糖处理后活化的星形胶质细胞亚型的表现情况中。酶联免疫吸附试验结果回报:与正常组大鼠脊髓星形胶质细胞培养基相比,其余三组进行了OGD/R损伤的细胞培养基中的HMGB1含量明显增高(P<0.05),且在复氧复糖24小时时,HMGB1含量达到峰值。Western Blot结果显示,与未进行OGD/R的正常培养的大鼠脊髓星形胶质细胞相比,氧糖剥夺/复氧复糖组大鼠脊髓星形胶质细胞C3蛋白的表达量增高(P<0.05),且在复氧复糖12小时后表达量最多。S100A10蛋白表达含量经氧糖剥夺损伤后也呈上升趋势,并且与正常组存在明显差异(P<0.05),其表达量最多的时间点在复氧复糖损伤后6小时。因为本实验侧重于A1型星形胶质细胞的研究,因此我们选择OGD6h/R12h作为后续实验的典型时间点。2.在第二部分实验中:观察抑制HMGB1后,对反应性星形胶质细胞亚型的影响以及对反应性星形胶质细胞功能的影响。ELISA结果显示:与氧糖剥夺/复氧复糖组相比,sh RNA转染组和HMGB1抑制剂EP组细胞培养基中HMGB1、谷氨酸、IL-1β、TNF-α的表达量明显降低(P<0.05),而阴性序列转染组与氧糖剥夺/复氧复糖组相比无明显差异(P>0.05)。Western Blot结果显示:与损伤组相比,sh RNA转染组和HMGB1抑制剂EP组C3蛋白、S100A10蛋白、和HMGB1表达减少(P<0.05),而阴性序列转染组与氧糖剥夺/复氧复糖组相比蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。3.在第三部分实验中:观察HMGB1通过Toll样受体4(TLR4)/核转录因子Κb(NF-κB)通路对大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后亚型的调节作用。ELISA结果显示:与氧糖剥夺/复氧复糖组相比,HMGB1抑制剂EP组和TLR4抑制剂CLI-095组以及NF-κB抑制剂BAY11-7082组细胞培养基中HMGB1、谷氨酸、IL-1β、TNF-α的表达量明显降低(P<0.05),而阴性序列转染组与氧糖剥夺/复氧复糖组相比无明显差异(P>0.05)。Western Blot结果显示:与损伤组相比HMGB1抑制剂EP组、TLR4抑制剂CLI-095组以及NF-κB抑制剂BA11-7082组C3蛋白、S100A10蛋白、TLR4蛋白、NF-κB蛋白表达减少(P<0.05),而阴性序列转染组与氧糖剥夺/复氧复糖组相比蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。结论:1.大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后,HMGB1释放增多,细胞开始向A1型和A2型反应性星形胶质细胞转化。2.抑制HMGB1可减少反应性星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞的转化。减少谷氨酸的释放,有利于神经系统损伤后的恢复。3.大鼠脊髓星形胶质细胞损伤可通过HMGB1/TLR4/NF-κB通路促进反应性星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞的转化。