研究背景慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）患者的数量持续增加,CKD进展过程中常伴随着肾脏间质持续的炎症反应以及不断增加的纤维化。肾纤维化是一种与肾脏损伤和功能丧失相关的进行性病理生理变化,是一个复杂的动态过程。由于缺乏对肾纤维化及时有效的预防和治疗手段,多数患者表现为渐进性的肾功能丧失,最终发展为终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）。肾脏对缺氧的病理生理过程尤为敏感,而在不同的应激刺激及疾病的发生发展中都伴随有缺氧过程,缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors,HIFs）在缺氧反应中则起着核心的响应和调控作用。在缺氧早期阶段,HIF-1α转录及蛋白表达升高,来调控细胞对缺氧的初始适应性反应,以减少组织细胞对氧气的需求,使细胞能快速的适应低氧的微环境从而达到新的平衡。当细胞内线粒体呼吸链受损,不能快速为细胞提供足够的能量时,细胞的供能会由线粒体氧化磷酸化转向有氧糖酵解,以保证细胞适应低氧和营养不足的微环境,这一代谢的改变被称之为代谢重编程,其作用不仅仅局限于能量的生产和供给,也涉及代谢变化过程中多种过程产物的产生和作用调控。代谢重编程的过程伴随着部分糖酵解代谢产物的增高以及三羧酸循环和氧化磷酸化代谢产物的降低,如乙酰辅酶A、乳酸、α-酮戊二酸等。这些代谢产物的改变,经活化/抑制各种信号分子使组织细胞内的基因、蛋白质发生了表观遗传改变,这类修饰变化可影响基因的转录复制及表达,并直接关系到疾病的发生以及进展。研究目的:本研究在动物及细胞模型中探究了肾脏损伤早期,HIF-1α是否通过影响肾小管上皮细胞代谢重编程,诱导细胞表观遗传学发生改变,促使纤维化相关基因DNA甲基化水平异常,进而导致肾纤维化发生和进展,通过探究这一调控轴在肾脏纤维化发生早期和进展中的作用机制,为肾损伤及早期肾纤维化的防治提供新思路及新策略。研究方法体内实验:雄性C57BL/6小鼠进行单侧输尿管阻断（UUO）手术,建立肾脏纤维化动物模型,于造模后1天、3天、7天分别处理动物收集样本进行检测分析。用HIF-1α抑制剂KC7F2干预动物并进行检测。体外实验:用AngⅡ干预肾小管上皮细胞HK2造模。分别用AngⅡ干预过HK2细胞的条件培养基、乳酸干预HK2细胞,对比观察。用HIF-1α抑制剂KC7F2干预细胞并进行检测。通过生物信息数据分析肾纤维化相关的差异表达基因及通路富集。建模完成后,对组织样本进行组织病理学染色观察肾脏组织病理改变,Masson染色观察损伤早期纤维化改变。免疫组织化学染色及免疫荧光染色法观察HIF-1α、α-SMA、fibronectin的蛋白表达及分布。试剂盒检测肾脏组织内GSH、MDA、ATP、乳酸水平,检测血清BUN、SCr水平。Western blot检测线粒体生物合成、动力学、呼吸链复合体相关蛋白、糖酵解相关蛋白、TET2蛋白表达、纤维化相关蛋白表达。seahorse检测细胞代谢通量OCR及ECAR变化。荧光探针染色、透射电镜扫描分析观察线粒体变化。亚硫酸氢盐修饰后测序,检测α-SMA、HIF-1α的DNA启动子区CpG位点甲基化水平。结果1.输尿管梗阻模型中肾脏组织差异表达基因显著增加,主要富集在细胞代谢、细胞粘附分子、细胞外基质等信号通路中。在输尿管梗阻早期,梗阻侧肾脏出现肾纤维化,HIF-1α表达快速升高,肾小管上皮细胞OCR降低、ECAR升高,线粒体功能及质量调控异常,能量代谢由有氧氧化转变为有氧糖酵解,即出现代谢重编程。2.肾纤维化早期肾小管上皮细胞的代谢重编程导致有氧糖酵解增强、糖酵解代谢产物水平增加,引起TET2表达升高,导致纤维化标志物α-SMA的DNA启动子区CpG位点甲基化水平降低,α-SMA、fibronectin蛋白表达升高,进而促进肾纤维化发生。3.给予KC7F2靶向抑制HIF-1α表达,可降低代谢重编程,降低对TET2酶的活化作用,提高α-SMA的DNA启动子区甲基化水平,减少其蛋白表达,从而延缓并减轻肾纤维化。结论肾纤维化早期HIF-1α表达快速升高,诱导了肾小管上皮细胞的代谢重编程,有氧糖酵解水平升高,氧化磷酸化水平下降,导致糖代谢过程中代谢产物水平的改变,引起TET2蛋白表达上调,纤维化相关蛋白α-SMA的DNA启动子区CpG位点甲基化水平降低,α-SMA蛋白表达增加,进而促进肾纤维化发生,抑制HIF-1α可降低TET2表达,改善早期肾纤维化的发生。