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先天性心脏病(简称先心病)是我国儿童最常见的出生缺陷病之一,全球发病率约为9/1000,在我国已成为先天畸形的首位病种。圆锥动脉干畸形是一类由于流出道发育异常导致的先天性心血管畸形,占全部先心病的30%,包括法洛四联症、右室双出口、大动脉转位、永存动脉干、肺动脉闭锁等,可以导致新生儿时期出现低氧血症和难以纠正的酸中毒,自然预后不佳。部分患儿经过外科手术纠治后仍将存在一系列残余问题,从而影响患儿的生活质量,并且给社会和家庭带来较大的经济和精神负担。目前,普遍的观点认为先心病是内在遗传易感因素和外界环境致畸因素共同作用的结果。随着分子生物学的不断发展,包括TGFβ2在内的遗传易感基因成为研究热点。TGFβ2是高度保守TGFp超家族成员之一,具有多种生物学作用。基因敲除的小鼠会导致心脏出现包括右室双流出道、房室管畸形等多种圆锥动脉干畸形,在维甲酸处理的小鼠胚胎中,内源性TGFβ2表达降低,小鼠心脏出现流出道隔发育异常。Kubalak等研究发现,RXRA敲除小鼠中TGFβ2表达升高,使得细胞凋亡增加,从而导致胚胎出现流出道发育的异常。推测TGFβ2基因很可能是圆锥动脉干畸形的致病易感基因。然而,尽管动物实验结果显示TGFβ2基因与心脏的畸形发育有密切的相关性,但是人类圆锥动脉干畸形与TGFβ2基因的相关研究还非常有限。本课题拟研究TGFβ2基因在圆锥动脉干畸形患儿中的基因型,探寻可能导致圆锥动脉干畸形发生的突变或者单核苷酸多态性,以及分别从转录和翻译水平探究TGFβ2基因在圆锥动脉干畸形患儿流出道组织中的表达水平,并且与正常流出道组织中TGFβ2基因表达水平相比较,探讨TGFβ2基因与人类圆锥动脉干畸形发生的关系,为进一步深入研究圆锥动脉干畸形的发生机制提供实验依据和立论基础。第一部分圆锥动脉干畸形患儿TGFβ2基因编码区DNA序列分析目的：通过对圆锥动脉干畸形患儿TGFβ2基因外显子编码区序列的检测,探寻可能存在的导致疾病发生的基因变异,明确TGFβ2基因是否为圆锥动脉干畸形发生的遗传易感基因及其变异位点。方法：应用PCR技术以及测序方法,选取400例确诊为圆锥动脉干畸形的患儿的外周血,检测TGFβ2基因外显子编码区序列,分析编码区序列的改变并探寻这些改变与圆锥动脉干畸形发生的关系。结果：入选的400例圆锥动脉干畸形病人诊断分类包括法洛四联症、左室双流出道、右室双出口、大动脉转位和肺动脉闭锁。对TGFβ2基因外显子编码区序列检测,400例圆锥动脉干畸形患儿血样中有一例存在一个杂合变异c.597T>C,此种变异位于第四外显子,但是没有引起所编码氨基酸的改变,仍然为异亮氨酸,我们在UCSC数据库中并未查到此种变异,认为其为新发现的同义突变。小结：在400例圆锥动脉干畸形患儿TGFβ2基因外显子编码区序列检测中,发现1例患儿存在一个同义突变,即c.597T>C,编码的氨基酸仍然为异亮氨酸。因此认为,TGFβ2基因编码区突变不是出生后儿童圆锥动脉干畸形发生的常见原因。第二部分圆锥动脉干畸形患儿心脏流出道组织TGFβ2基因mRNA表达水平检测目的：观察TGFβ2基因mRNA在圆锥动脉干畸形患儿心脏流出道组织的表达水平,并比较与正常儿童表达量的差异,探讨TGFβ2基因表达水平对人类心脏发育的影响。同时检测正常胎儿心脏组织TGFβ2基因的表达水平,探寻TGFβ2基因在人类心脏发育过程中的表达特点。方法：选取圆锥动脉干畸形患儿心肌流出道组织57例作为病例组,由5例正常儿童流出道心肌组织和13例成人流出道心肌组织作为对照组；20例胎儿正常心脏组织应用于研究TGFβ2基因在人类心脏发育过程中的时序表达特点。所有组织经过RNA提取,应用real-time PCR检测TGFβ2基因在人类心脏中的表达水平,运用Mann-Whitney检验,认为P<0.05时差异具有统计学意义。结果：1.TGFβ2基因mRNA表达在圆锥动脉干畸形患儿心肌组织中与正常对照中比较,其表达差异无统计学意义。2.TGFβ2基因mRNA在胎儿正常心脏组织中表达量明显高于出生之后的圆锥动脉干畸形患儿和正常对照。3.TGFβ2基因mRNA在胎儿正常心脏中的表达水平,呈现出随着胎龄的逐渐增大,表达水平逐渐降低的负相关趋势。小结：1.TGFβ2基因mRNA表达水平在病例组和对照组中并无明显差异。由于TGFβ超家族成员具有相似的分子结构、表达方式和生物学作用模式,各亚型之间可发挥一定补偿作用,提示TGFβ2基因对圆锥动脉干畸形的产生机制并不是发生在转录环节。本部分结果不能证明TGFβ2与人类CTD的发生具有明显的关系。2.明确TGFβ2在人类心脏发育过程中呈现一种时序性表达方式：TGFβ2基因表达在胚胎发育中明显高于出生之后,且表达量与胎龄呈负相关趋势,出生后的表达量维持在一定水平。第三部分圆锥动脉干畸形患儿心脏流出道组织TGFβ2基因蛋白表达水平检测目的：观察TGFβ2基因蛋白在圆锥动脉干畸形患儿心脏流出道组织的表达水平,并比较与正常儿童表达量的差异,探讨TGFβ2蛋白表达水平在圆锥动脉干畸形发生过程的作用机制。方法：选取12例圆锥动脉干畸形患儿和3例正常儿童心肌流出道组织作为研究对象,运用免疫组化方法检测TGFβ2基因蛋白质表达水平的差异。结果：本研究显示,在人类心肌组织中,TGFβ2基因蛋白质的表达水平在病例组与正常对照组中无明显差异。小结：TGFβ2蛋白在圆锥动脉干畸形患儿中的表达水平与对照组并没有明显差异,不能证明TGFβ2与人类CTD的发生具有明显的关系。目前的结果尚不能排除TGFβ2基因对CTD发生的影响,需要进一步全面的研究。