硬皮病(Scleroderma)作为一种累及皮肤和内脏器官的自身免疫性结缔组织病,纤维化是其病理改变的核心环节,TGF-p是目前被公认最强的致纤维化因子之一,它能促进体内组织活性氧(ROS)异常合成,形成的氧化应激反应,此反与胶原合成增加密切相关。PDGFA作为纤维化进程的上游因子,在硬皮病患者的血清高度表达,其与受体特异性结合可诱使成纤维细胞和肌纤维母细胞增殖,造成胶原组织沉积及纤维化,同时ROS通过抑制硬皮病患者体内磷酸酶活性,促使PDGF与其受体持续结合,加强纤维化增生。此外,PDGFA与TGF-β诱导的纤维化过程存在交互作用,两者通过协同作用可诱导结缔组织生长因子(CTGF)的高表达从而促进纤维化的发生。因此对硬皮病纤维化的治疗成为硬皮病硬化期治疗的关键,现代医学对硬皮病的治疗主要是对症治疗,段师段行武教授自拟活血除痹汤,以养血活血、通络除痹之法治疗硬皮病硬化期,取得了良好的临床疗效。为进一步研究活血除痹汤治疗硬皮病硬化期纤维化的作用机制,我们以模拟硬皮病硬化期皮损的小鼠为实验对象,观察活血除痹汤对其纤维化的抑制效果,以及对致纤维化相关性因子的调控作用。以期为活血除痹汤治疗硬皮病纤维化的具体作用机制提供实验室理论的基础。本研究由文献综述、段师治疗经验介绍及实验研究三部分构成。其中文献综述三篇,综述一主要论述了西医对硬皮病发病机制的研究及硬皮病临床诊断标准的演化,综述二主要论述了西医对硬皮病的治疗及相关研究,综述三主要论述了中医对硬皮病病因病机的理解及治疗方面的研究。实验目的：观察活血除痹汤对硬皮病硬化期皮损的干预效果,通过数据比较证明：①异常氧化应激反应存在于硬皮病硬化期皮损中②活血除痹汤能有效缓解皮肤增厚,降低胶原指数,抑制氧化应激反应③活血除痹汤能有效抑制致纤维化相关性因子TGF-β/PDGFA及对纤维化的发生。方法：(1)实验一将18只BALB/c小鼠小鼠随机分组为①空白组②模型低剂量组③模型高剂量组(每组6只)后以PBS 0.1ml/日对①进行皮下注射；分别以浓度400μg/0.1ml、800μg/0.1ml的博来霉素溶液0.1ml/日对②③组进行皮下注射4周后处死小鼠采取皮肤组织进行HE染色及Masson染色观察比较皮肤增厚程度及皮肤胶原指数以掌握最合适模拟硬皮病硬化期皮损的博来霉素造模浓度。(2)实验二将30只BALB/c小鼠随机分为①空白组②模型组③中药高剂量组④中药中剂量组⑤中药低剂量组(每组6只)；以PBS 0.1ml/日对①进行皮下注射；以400μg/0.1ml的博来霉素溶液0.1m1/日对②至⑤组进行为期4周的造模,于5-8周分别以不同浓度的活血除痹汤药液(按成人体重换算浓度为：44.8、22.4、11.2g/(kg·d)) 2ml/日对③④⑤灌喂；①②以同比体积的蒸馏水进行灌胃。于第8周末处死小鼠采取皮肤组织进行观察皮肤厚度、胶原指数以及皮损中ROS含量的变化。(3)实验三对硬皮病硬化期小鼠进行造模及不同浓度的中药干预后,对各组的硬皮病纤维增生相关因子TGF-β/PDGFA以及它们的下游产物COL-Ⅰ及COL-Ⅲ进行免疫组化染色后测量其变化。结果：(1)实验一：结果显示②造模低剂量组与③造模高剂量组与①空白组比较,皮肤厚度及胶原指数均增加明显,具有明显的统计学差异(P<0.01)。②与③相比,②的皮肤厚度及胶原指数均高于③,具有明显的统计学差异(P<0.01)。小鼠皮肤外观表现为硬化增厚、披毛脱失、毛囊萎缩消失；显微镜下观察病理变化可见真皮层明显增厚,胶原纤维束数量增加、增粗膨大,纤维间隙变窄,毛囊萎缩,真皮血管周围和间质内有炎性细胞浸润,血管壁明显增厚,脂肪层减少甚则消失,皮肤附属器减少明显等符合硬皮病临床皮肤病理变化的表现。(2)实验二：结果显示②模型组①空白组比较,皮肤厚度、胶原指数以及皮损ROS含量均明显升高,具有明显的统计学差异(P<0.01)。③中药高剂量组④中药中剂量组⑤中药低剂量组与②模型组比较,皮肤厚度、胶原指数均明显降低,具有明显的统计学差异(P<0.01)；其中③的皮肤厚度与胶原指数明显低于④⑤(P<0.01)。皮损ROS含量方面③与④⑤间存在明显的统计学差异(P<0.05,P<0.01),④与⑤ROS含量差异不明显(P>0.05)。相关性分析表示：皮损ROS含量与皮损厚度呈正相关(r=0.891,P<0.01)、皮损ROS含量与皮肤胶原指数呈正相关(r=0.866,P<0.01)、皮肤厚度与胶原指数呈正相关(r=0.942,P<0.01)。(3)实验三：结果显示②模型组①空白组比较,致纤维化相关因子TGF-β/PDGFA含量及COL-Ⅰ/Ⅲ生成均明显升高,具有明显的统计学差异(P<0.01)。③中药高剂量组④中药中剂量组⑤中药低剂量组与②模型组比较,致纤维化相关因子TGF- β/PDGFA含量及COL-Ⅰ/Ⅲ生成均明显降低,具有明显的统计学差异(P<0.01)；其中③的各项指标明显低于④⑤,存在明显的统计学差异(P<0.01)。④在各项指标之间明显低于⑤存在明显的统计学差异(P<0.01)。相关性分析表示TGF-β含量与皮损ROS浓度呈强相关性(r=0.87,P<0.01)、PDGFA含量与ROS浓度呈强正相关性(r=0.88,P<0.01)、TGF-β含量与COL-Ⅰ/Ⅲ含量呈强相关(r=0.96,P<0.01, r=0.95,P<0.01).PDGFA含量与COL-Ⅰ/Ⅲ含量呈强相关(r= 0.96,P<0.01,,r=0.97,P<0.01)结论：(1)博来霉素皮下注射诱发硬皮病硬化期小鼠模型的最佳浓度为400μg/0.1ml,为期4周；模型小鼠的皮肤外观及显微镜下的病理变化皆符合硬皮病硬化期的皮肤损害。(2)硬皮病硬化期模型小鼠的皮损中有大量的ROS生成,且ROS浓度与皮损的厚度及胶原指数呈正相关,说明氧化应激反应与皮肤纤维增生有较强的关系；随着活血除痹汤干预的浓度增加,ROS含量、皮肤厚度及胶原指数呈同比下降,说明活血除痹汤抑制皮肤纤维增生可能通过减少ROS的生成产生作用。(3)硬皮病硬化期模型小鼠的皮损中致纤维化因子TGF-β、PDGFA与皮损中COL-Ⅰ/Ⅲ的表达呈正相关,随着活血除痹汤干预的浓度增加,TGF-β、PDGFA与COL-Ⅰ/Ⅲ呈同比下降,说明活血除痹汤能抑制模型小鼠皮肤中TGF-β、PDGFA的含量达到抑制纤维化的目的,且对COL-Ⅰ/Ⅲ的生成可能有直接或(与)间接抑制的作用。(4)模型小鼠皮肤中的ROS含量与与TGF-β及PDGFA含量呈强相关性,说明在纤维化的过程中,ROS、TGF-β、PDGFA之间有较密切的关系。(5)活血除痹汤在干预硬皮病硬化期模型小鼠皮损效果确切,且在高浓度下效果最佳。