研究背景：慢性移植物肾病(CAN)是移植物丢失的主要原因,有研究报道显示肾移植术后1年常规活检60-70%的移植物有CAN征象,随着肾移植受者数量的日益增加和供体的短缺,器官移植研究的重心已经从针对CAN治疗而阐述其发生发展机制的临床和基础方面转移到如何改善移植物的长期存活。CAN在临床上表现为肾移植术后3月后,移植肾功能进行性减退,最终肾功能衰竭,病理上以肾小管萎缩、间质纤维化和肾小球硬化等为特点的非特异性改变。而临床上主要表现为进行性蛋白尿、高血压和血肌酐持续缓慢升高。CAN的病因学包括免疫因素和非免疫因素,而且这些因素之间相互作用使得诊断和治疗非常困难。由同种异体抗原导致的持续活动但缓慢进展的移植物损伤合并非特异非免疫因素使移植物损伤进一步恶化,也就是说免疫损伤也即是慢性排斥反应是发生CAN的基础,基于这种共识,在本文中我们更注重CAN发生的免疫因素,但这并不是将导致CAN的各个因素分离,我们试在免疫因素的基础上阐述CAN发生的可能机制。近几年来,移植肾抗体介导的体液排斥反应的重要性得到越来越多的认识,原因有四：首先,有关抗体检测的技术得到很大的进步,应用以供者细胞为基础的纯化HLA抗体的有关技术使以前不能检测到的低水平供者特异性抗体(DSA)得以检测；其次,抗体介导的体液排斥反应在组织学的表现得到更多认识,管周毛细血管C4d沉积是移植肾所特有的,是体液免疫的第一个免疫组化标志,是一个有临床应用价值的免疫标志物,Banff2005已经把C4d在PTC沉积与肾小球基底膜增生分层和动脉内膜纤维性增厚一起作为慢性活动性抗体介导的排斥的病理诊断标准；第三,在移植前后应用血浆抗体清除技术使ABO血型不相容的肾移植取得了满意的成果；最后,在传统移植理论中,抗HLA抗体严重限制了受者的可移植性,新的移植免疫技术如避开致敏位点等使抗HLA抗体阳性受者的肾移植得以顺利实施。这些移植虽然经常成功,但增加了移植肾排斥反应的风险。目前有关体液免疫对移植物的影响的研究集中在急性排斥反应,但在长期存活和CAN方面的影响研究较少。CAN的临床决策首先建立在移植物活检Banff分级上,然而,微小的或非特异性的细胞浸润在Banff分级及其解释中未阐明,其中B淋巴细胞浸润就比较常见。CD20是B淋巴细胞的一个表面标志,在原B淋巴细胞开始表达,直至成熟的B淋巴细胞,分化到浆细胞后表达消失。B细胞在免疫应答过程中发挥多重作用,既可接受抗原刺激,活化、增殖为成熟浆细胞,分泌抗体介导体液性排斥反应；又可作为抗原提呈细胞,摄取、加工并提呈抗原刺激T淋巴细胞活化参与细胞性排斥反应,如类风湿性关节炎患者关节腔内T细胞的活化是通过滑液周围淋巴滤泡CD20阳性淋巴细胞来实现的。但CD20阳性B淋巴细胞在移植免疫中的作用机制研究较少。目前有关的研究主要集中在CD20阳性淋巴细胞在急性细胞性排斥中的作用,发现CD20阳性阳性淋巴细胞浸润与耐激素型急性排斥反应和移植物的预后相关,抗CD20单克隆抗体在肾移植临床也有应用,主要用于治疗耐激素型急性排斥反应。但在影响绝大多数移植物预后的CAN中CD20阳性淋巴细胞可能充当的角色研究较少。研究目的：本研究结合C4d、循环抗体PRA等体液免疫指标,旨在探讨CD20阳性淋巴细胞浸润在移植物CAN中的可能作用及其对移植物预后的影响,这项研究将为临床工作中针对加强B细胞的免疫抑制提供重要的依据和检测指标。研究对象和方法：一.收集了本院44例肾移植术后2年内有指征行移植肾穿刺活检并已证实CAN的标本,同时记录入选病例一般资料如性别、年龄、体重、供肾类型、配型、DGF、抗体诱导治疗、基础免疫抑制方案和穿刺前活检时间、PRA、血清肌酐值。二.常规病理检测,行CAN标本病理分级,同时采用免疫组化技术检测CD20的表达和C4d的沉积,肾皮质和髓质非纤维化或非坏死的区域局灶或弥漫的、沿肾小管周围毛细血管的、强的深褐色物质为C4d沉积；围绕在邻近肾小管25%以上毛细血管有C4d沉积判定为阳性；移植肾间质弥漫的、强的、聚集性的染色判定为CD20的表达,每高倍视野大于或等于300个CD20阳性细胞为阳性(≥300 cells/hpf)。三.PRA的检测：取患者全血5ml,应用酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定群体反应性抗体(panel reaction antibody, PRA),用电脑软件分析打印结果。四.根据病例随访,记录入选病例血清肌酐值、移植物存活情况。五.统计学方法：统计学处理采用SPSS130软件包进行统计学分析,计量资料采用均数士标准差表示,率间比较采用X2检验,均数比较采用独立样本t检验,等级资料比较采用秩和检验。统计学的显著性水准定为0.05。结果：所有病例随访至少1年,随访终点为移植物失功行肾脏替代治疗或病例死亡,无病例死亡,所有病例未出现失随访,随访期间未出现移植物失功受者。一、移植物CAN分级44例CAN病例中男性24例,女性20例,年龄范围21～69岁,平均年龄38.5±7.6岁,体重范围42～68kg,平均体重52.5±6.6kg,活检时间距肾移植术后时间为5-24月,平均为15.3±4.9月,供肾类型尸肾35例,亲属活体供肾9例,HLA配型中,0错配5例,1错配8例,2错配13例,3错配13例,4错配6例,基础免疫抑制方案中,以环孢素为基础的为14例,以普乐可复为基础的为30例,其中普乐可复合用五酯胶囊的为16例,未合用的为14例,抗体诱导治疗的为14例,发生DGF的为7例。所有病例经病理检查,按照Banff05分级,Ⅰ级为19例(43.2%),Ⅱ级16例(36.4%),Ⅲ级9例(20.4%),在CAN的不同分级中,基础免疫抑制方案环孢素组和普乐可复组所占比例无统计学差异,其中普乐可复组分为合用五酯胶囊组和未合用组,两组占CAN不同分级中比例也没有统计学差异。二、移植肾组织CD20的表达所有入选CAN标本中,检测到CD20阳性淋巴细胞浸润13例(29.5%),CD20阴性为31例(70.5%),CD20阳性淋巴细胞在组织中表现为聚集性和分散性浸润,CD20阳性组和阴性组在性别、年龄、体重、HLA配型、供体类型、基础免疫抑制方案、抗体诱导治疗和DGF发生率方面的差异无统计学意义。所有CD20阳性组中其中CANⅠ级5例(26.3%)Ⅱ级4例(25.0%),Ⅲ级4例(44.4%),CD20阳性表达与CAN分级差异无统计学意义,CD20阳性组病理表现CAN伴有AR者10例,仅有CAN病例3例,伴有AR组与不伴有AR组两组之间CD20阳性率有统计学差异。三、移植肾组织C4d的表达免疫组化染色示CAN病例中12例(27.3%)出现管周毛细血管内皮细胞(PTC)C4d的线性沉积。其中Ⅰ级为6例(31.6%),Ⅱ级4例(25.0%),Ⅲ级2例(22.2%),CAN不同分级中C4d的阳性率无统计学差异,PTC的C4d沉积与CD20阳性淋巴细胞浸润的相关性分析显示两者关联性小,无统计学意义。四、移植肾组织CD20、C4d的表达与PRA和移植物功能的关系PRA阴性组和阳性组的CD20阳性率分别为21.6%和71.4%,两者阳性率有统计学差异。移植肾穿刺前CD20阳性和阴性组平均肌酐水平分别为140.8±22.0μmol/L和183.5.4±25.5μmol/L,穿刺后1年肌酐水平分别为165.6±37.6μmol/L和242.2±59.1μmol/L,穿刺前和穿刺后1年CD20阳性组和阴性组的肌酐水平均有统计学差异,移植肾穿刺前C4d阳性和阴性组平均肌酐水平分别为186.1±55.1μmol/L和193.9±62.7μmol/L,穿刺后1年肌酐水平分别为154.7±29.3μmol/L和149.9±33.6μmol/L,穿刺前和穿刺后1年CD20阳性组和阴性组的肌酐水平均无统计学差异。结论一.以普乐可复为基础的免疫抑制方案和以环孢素为基础免疫抑制方案的CAN分级无统计学差异,普乐可复组中CAN分级与是否合用五酯胶囊无相关,五酯胶囊提高的浓度具有有效性。二.CAN一个重要的危险因素可能是不断进展的慢性体液免疫反应(CHR)。三.正常的肾组织中CD20阳性淋巴细胞是不表达的,在排斥反应和CAN病例标本中是高表达的,尤其是在伴有急性排斥反应,出现聚集性浸润,移植物CD20阳性淋巴细胞浸润与CAN分级不存在相关性,与C4d在PTC的沉积也没有相关性,但与受者循环抗体PRA存在相关性,CD20阳性淋巴细胞的浸润与移植物的预后和长期存活相关,其机制可能不是通过慢性体液免疫机制,而是B细胞作为抗原递呈细胞递呈供者抗原后被T细胞识别并引起T细胞的激活所致。四.移植物中CD20阳性淋巴细胞浸润与移植物预后相关,可能具有诊断意义,为B细胞清除药物治疗在治疗排斥反应的进一步临床试验提供了基础。