背景及目的:Ⅲ型前列腺炎(CPPS)是临床上最常见的慢性前列腺炎,迄今病因不清,治疗困难。一直以来,人们主要对其感染外的病因进行了探索并提出了多种假说,但均不能解释该病的临床特点。炎症标记物阳性、钙化灶的存在以及抗生素治疗有效,提示我们可能有不被常规检查方法发现的感染因素存在。新发现的纳米细菌(Nanobacteria,NB)以其独特的生理和致病特点为阐明CPPS的病因提供了一条崭新的思路。NB是新发现的纳米级球菌,在普通的微生物培养条件下不能生长,只能在细胞培养基上生长。常规方法不能检测。具有生长缓慢、抵抗力强、对药物不敏感以及耐高温强酸等特性。它能感染人体内多种细胞,通过释放毒素引起组织炎症,同时导致被感染细胞发生病理性钙化。已有研究证实人体多种疾病的发生与纳米细菌感染有关。有学者通过ELISA发现CPPS患者血液中NB的检出率高于正常男性及前列腺增生患者;对难治性CPPS患者抗NB治疗后,患者疼痛症状缓解,炎症程度减轻。因此我们推断NB可能和CPPS的发病具有密切关系。为了证实我们的假设,本研究首先拟用CPPS患者的EPS和前列腺结石进行NB的分离、培养,初步研究NB与CPPS发病的关系;其次用培养的NB感染动物前列腺,观察其中的病理变化,进一步验证NB在CPPS发生中可能的病因学作用;最后在基因水平研究NB与CPPS发病的关系,为临床上纳米细菌致CPPS的诊断提供一条新的检测途径,同时为研究纳米细菌的遗传背景和致病机理打下一个基础。方法:1.本研究拟从CPPS患者的EPS和前列腺结石中分离培养NB,并采用间接免疫荧光、电镜观察、钙染色等方法对培养物进行鉴定。2.选用成年雄性SD大鼠为实验对象,建立动物模型。模型组由SD大鼠尿道逆行注入NB于前列腺尿道部,造成大鼠前列腺感染。对照组注入生理盐水。分别于1周、2周、4周和8周时分批处死对照组和模型组SD大鼠,观察前列腺组织的病理变化。同时检测组织中白细胞数量及相关的细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)变化。同时将实验大鼠前列腺组织处理后进行NB的再分离培养,观察有无NB生长。3.通过双向电泳在NB培养物中寻找差异性蛋白,获取同源蛋白的氨基酸序列,再根据同源蛋白的基因序列设计出PCR引物,扩增纳米细菌的DNA片段并进行测序,将测序结果与NCBI数据库进行比对,初步鉴定目的基因。同时将特异性基因扩增用于临床上各型前列腺炎患者的鉴别诊断,并将基因诊断结果与NB培养鉴定结果进行对照,进一步验证基因诊断的准确性。结果:(一)纳米细菌培养及鉴定结果1.在从CPPS患者的EPS和结石分离的标本培养3-4周后,观察发现部分培养管底部出现紧贴管壁生长的白色沉淀。2.单抗间接免疫荧光染色对NB进行鉴定,CPPS组48例EPS标本中有26例中存在着NB感染,阳性率为54.2%;而正常对照组40例EPS标本中仅有2例存在NB感染,阳性率为5%。二组比较有明显差异(P<0.05)。20例结石组标本中,则发现有12例存在NB感染,阳性率为60%。3.透射电镜下观察,可见NB大小不一,约在200～500nm之间,菌体周围有一层黑色的物质包绕,其厚度大约在10nm左右,周围有羟基磷灰石分布。4.纳米细菌在扫描电镜下形态不规则,大多数近似为圆形或椭圆形,直径约在150～600nm之间;能谱分析显示,纳米细菌的矿化外壳主要含有钙、磷等元素,其钙磷比值为1.54,与前列腺结石的能谱分析结果相近。5.茜素红-S染色(钙染色)观察结果:显微镜下可见钙染色阳性的桔红色颗粒,大部分桔红色颗粒密集成簇,个体极其微小,布满整个视野。(二)制作纳米细菌致大鼠CPPS模型的实验结果1.NB感染后1周、2周、4周、8周时模型组前列腺组织中白细胞数量及相关的细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)与对照组比较均有明显差异。2.NB感染1～2周时,模型组大鼠前列腺呈急性炎症改变,组织充血、水肿,光镜下可见间质水肿、血管扩张,炎细胞浸润;4周～8周时,SD大鼠前列腺呈慢性炎症改变,腺体萎缩变硬,表面有灰白色点状结节,光镜下可见腺腔缩小甚至闭锁,间质纤维组织增生明显,大量淋巴细胞浸润。3.在TEM下观察可见模型组上皮细胞内线粒体肿胀,数量减少,内质网排列紊乱,扩张明显,上皮细胞内有较多球形颗粒,切断面可见圆形的纳米细菌,其周围组织呈透明、空泡状改变;在SEM下观察可见模型组前列腺上皮细胞表面有球形的纳米细菌,前列腺组织中有微结石形成,在微结石切面上可以看到颗粒状的纳米细菌,聚集成团。4.前列腺组织免疫组化结果:显微镜下可见模型组的前列腺上皮细胞周围、腺腔内以及间质细胞周围有棕黄色颗粒分布。对照组未见上述表现。5.动物前列腺组织再培养后发现模型组共有35例前列腺标本NB培养阳性,对照组则没有1例前列腺标本NB培养阳性,两组比较有明显差异。(三)纳米细菌致CPPS特异性基因诊断的实验结果1.通过双向电泳和质谱分析发现纳米细菌的一种差异性蛋白,同时获得其同源蛋白的氨基酸序列。2.通过PCR扩增获取一段新的基因序列,核酸序列与NCBI数据库中的已知序列进行比对,未发现有相似结果。3.我们提取正常男性,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前列腺炎患者EPS标本的DNA模板,利用特异性引物进行PCR扩增,从结果中我们可以发现只有Ⅲ型前列腺炎患者EPS标本的DNA模板扩增出特异性片段。4.纳米细菌培养和鉴定阳性的标本与PCR扩增出特异性片段的标本一致。结论及展望:1.CPPS患者前列腺液和前列腺结石标本中存在NB,并且有较高的阳性率。2.NB感染能引起大鼠前列腺组织发生炎症改变,模型组前列腺1-2周时呈急性炎症改变,4周后即呈慢性炎症改变。3.NB感染可以引起大鼠前列腺组织中白细胞数量增高,同时使TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质水平升高。4.动物前列腺组织再培养后发现NB阳性,说明动物模型的建立符合Koch氏原则。5.通过PCR扩增获取一段新的基因序列,而且只有部分CPPS患者EPS标本的DNA模板可以扩增出特异性片段,说明特异性基因扩增可用于临床上NB致CPPS的诊断。6.NB培养和鉴定阳性的标本与PCR扩增出特异性片段的标本一致,这就进一步证实了特异性基因扩增诊断NB致CPPS的准确性。7.NB感染与CPPS发生、发展可能存在着密切的关系。8.基因水平的研究结果为临床上NB致CPPS的诊断提供了一条新的检测途径,同时为研究NB的遗传背景和致病机理打下了一个基础。