外源DNA高效率的进入消化道内皮细胞是消化道基因治疗需要解决的问题之一,对外源DNA载体进行适当改造,从而使其比较容易的进入肠道内皮细胞,是解决这个问题的最简便方法.来自HIV-1的TAT(trans-activator,逆转录因子)蛋白能够高效地介导多肽、蛋白质、基因以及一些其它的外源物质进入细胞,受外界因素的干扰和影响较小:不受血清蛋白的影响,对温度变化不很敏感,对机体没有任何的毒副作用,并且可以直接作用于机体细胞,因而在消化道基因治疗方面具有较好的应用潜力.乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病.重组乙肝表面抗原(HBsAg)能在一定程度上有效地抑制乙型肝炎的流行.但通过大肠杆菌系统表达的HBsAg多肽费用较高、程序复杂,并且有因污染细菌内毒素引起副作用的可能,因此,探索有效的口服消化道基因疫苗技术具有重要的实用价值.酿酒酵母是与人类共生的重要微生物,由于其正常情况下无致病性,无内毒素,因而被广泛应用于食品与制药行业.将TAT多肽连接在HBsAg上游,再通过酵母系统从消化道系统导入机体、进而刺激机体产生对表面抗原的免疫活性,理论上是可行的.从酿酒酵母文库质粒pHSS6-mTn-3×HA/LacZ中筛选出的酵母同源重组载体,通过LacZ基因的表达显色,判断该基因上游启动了的强弱,检出具有强启动了的理想重组载体,用于后续实验.用PCR方法将TAT蛋白PTD(protein transduction domain)区域的14个氨基酸编码基因构建到HBsAg基因的上游,得到TAT-HBsAg融合基因,并将其连接到筛选出来的载体中.构建好的质粒以NotⅠ酶切,转化酿酒酵母,进而在酵母中同源重组,通过检测LacZ基因的显色反应筛选得到阳性重组菌株,提取重组菌株的蛋白质,用ELISA的方法检测到HBsAg蛋白的表达.以上研究结果表明,利用筛选出的理想同源重组的载体,成功构建了重组质粒pHSS6-mTn-3×HA/LacZ-TAT-HBsAg,目的基因TAT-HBsAg成功重组到酿酒酵母中并得到表达.该研究将为口服基因治疗提供进一步的证据,为乙型肝炎口服基因疫苗的实现,提供了新的理论和实验途径.