论文部分内容阅读
抗氧化肽是由2-20个氨基酸组成的活性多肽序列,对清除机体自由基、维持氧化还原动态平衡、防止组织损伤、衰老以及预防心脏病、肿瘤等疾病的产生具有至关重要的作用。油用牡丹籽粕（Po SM）作为榨油后的副产物含有丰富的粗蛋白和膳食纤维,可以作为植物蛋白和抗氧化肽的天然来源。本论文以Po SM为原料,对其进行一般成分和营养成分测定;对油用牡丹籽粕蛋白（Po SMP）和多肽进行制备、功能性质进行研究,成功鉴定出五种新型抗氧化多肽序列;最后,运用量子化学计算对鉴定出的新型多肽进行构效关系研究。研究结果为油用牡丹副产物的利用及新型抗氧化肽的开发提供了依据。具体内容如下:1. 油用牡丹籽粕一般成分和营养成分研究。对Po SM的一般成分、氨基酸、微量元素以及维生素等进行测定。研究结果表明,Po SM中蛋白质的含量为20.2%,天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的含量分别为1.83 g/100g和4.85 g/100g,其中必需氨基酸的含量为33.7%。此外,微量元素磷P、钾K的含量分别为5.11×103mg/kg、4.28×103mg/kg。Po SM富含蛋白质、必需氨基酸及微量元素等。Po SM可作为蛋白和抗氧化肽的优质来源。2. 蛋白质和酶解产物的制备及功能性质研究。采用碱溶酸沉法提取Po SMP,考察料液比（g/m L）、提取时间（min）、p H和提取温度（℃）对蛋白提取率的影响,并采用四因素三水平响应面法进行优化。结果表明在p H=10,52℃,76.92 min,1:14.3 g/m L时Po SMP的提取率最高为55.17%。以水解度和体外抗氧化性为指标,在五种水解酶中,碱性蛋白酶具有最高的水解度和较好的ABTS、OH自由基清除活性。理化性质研究表明,Po SMP相对分子质量主要分布在23k Da和34 k Da附近且23 k Da处的蛋白表现出较强的耐消化性;当p H分别为4.5和3.7时Po SMP和AHs（碱性蛋白酶酶解产物）的溶解度最低,在中性条件下两者均表现出良好的溶解度;Po SMP、AHs的变性温度分别为67℃和83℃。Po SMP具有耐高温、强酸和弱碱性,AHs则具耐高温、强酸和强碱的特性,且两者均没有明显的细胞毒性。3. 抗氧化肽的纯化与鉴定研究。依次选取超滤（10、5、1 k Da）、强阴离子交换色谱(Hi TripT M Q HP)、反相高效液相色谱（RP-HPLC）对AHs进行纯化富集,通过Nano LC-MS/MS技术鉴定出五种新型的抗氧化多肽,多肽序列分别为FSAP（Phe-Ser-Ala-Pro）,PVETVR（Pro-Val-Glu-Thr-Val-Arg）,QEPLLR（Gln-Glu-Pro-Leu-Leu-Arg）,EAAY（Glu-Ala-Ala-Tyr）和VLRPPLS（Val-Leu-Arg-Pro-Pro-Leu-Ser）。体外抗氧化性实验表明,EAAY多肽序列的抗氧化活性最高,浓度为0.5 mg/m L时对ABTS和OH自由基清除活性分别为98.5±1.1%和61.9±1.3%。4. 量子化学计算对抗氧化多肽的构效关系研究。实验以量子化学计算为基础,对从PEP-FOLD网站上获取五种抗氧化肽的空间分布,采用半经验法PM6和密度泛函理论（DFT）B3LYP/6-31G*基组进行构象优化后,对五种抗氧化肽的前线分子轨道能级和活性位点进行研究。计算结果表明,HOMO（最高占据分子轨道）与LUMO（最低分子未占据轨道）的能隙差值与体外抗氧化自由基活性具有一定程度的吻合,该值可以作为理论评估抗氧化活性的指标之一。此外,自然键轨道（NBO）结果表明与自由基清除相关的氢原子转移的位点主要分布在末端氨基、精氨酸的胍基以及酪氨酸的酚羟基结构上。