子宫内膜异位症(Endometriosis,EM),简称内异症,是指子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位粘附、生长、周期性出血,继而形成包块或结节,引发疼痛、不孕等症状。虽然是育龄期妇女的常见病,内异症的发病机制至今不明且众说纷纭,目前仍以Sampson的经血逆流-种植学说为主导,该学说认为随经血逆流入盆腔的子宫内膜碎片经历粘附、增殖、血管新生等过程,形成异位囊肿或结节。但种植学说并不能解释为什么90%的女性发生经血逆流,而仅10%左右的育龄期妇女罹患内异症。这也提示我们内异症不仅与月经逆流相关,盆腔微环境引起的异位内膜生物学改变在内异症发病中的作用也不可忽视。月经期子宫内膜功能层螺旋小动脉持续性收缩,子宫内膜缺血缺氧,剥脱出血,形成月经,现有研究已证明随经血逆流的子宫内膜碎片在异位组织粘附生长前处于相对缺氧的状态。缺氧状态下缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达升高,介导内异症细胞克服缺氧环境并启动异位粘附-增殖-浸润等生物学行为。粘附被认为是异位病灶形成的第一步,有研究表明转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、粘附分子整合素Integrins家族在内异症粘连中发挥重要作用,但起关键作用的Integrins并未被阐明,HIF-1α、TGF-β1与内异症细胞异位粘附的具体关系也尚无报道。内异症细胞异位粘附之后仍然长期受到缺氧的应激,其在子宫腔外氧化应激环境下持续存活、复制的机制还不明确。Micro RNA-210(miR-210)是缺氧处理后上调最为显著的HIF-1α相关micro RNA,miR-210常通过其靶基因参与细胞周期进展、氧化应激(oxidative stress,OS)下的细胞分裂增殖、DNA损伤修复、血管新成及能量代谢转换等多项生物学过程,被认为是缺氧标志性的micro RNA。现有文献表明内异症异位病灶存在过度氧化应激,但异位病灶氧化/抗氧化失衡的机制不明。我们在前期缺氧促进子宫内膜间质细胞(ESCs)异位粘附的研究中发现长期慢性缺氧会导致子宫内膜间质细胞及上皮细胞发生DNA损伤,同时发现缺氧相关miR-210-3p在异位病灶的子宫内膜间质细胞和上皮细胞中表达均升高。目前,内异症细胞在异位粘附之后克服氧化应激压力持续存活、异常分裂增殖的机制尚不明确。我们应用Target Scan,RNA-hybrid和miRanda数据库预测到BARD1是miR-210-3p的靶基因。BARD1(BRCA1 associated RING domain 1,BRCA1相关环结构域)通过指环区与BRCA1相连形成异二聚体复合物,在细胞中发挥DNA损伤修复和激活细胞周期检测点的功能,且BARD1蛋白已被证明决定了BRCA1蛋白的稳定性及BRCA1/BARD1异二聚体复合物在细胞周期调控、DNA损伤应答、癌症进展中的功能,但目前尚无miR-210-3p及其靶基因参与内异症发病的报道。本研究基于经血逆流-种植学说,探讨了缺氧在内异位症发病三部曲之——异位粘附、异常增殖中的作用,证明了缺氧不但能够通过激活TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4/Integrins信号通路增加子宫内膜间质细胞的异位粘附能力,启动内异症的发生;缺氧上调的miR-210-3p还能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的降解,使BRCA1/BARD1蛋白复合物无法发挥正常的DNA损伤应答及细胞周期检测点功能,内异症细胞逃逸氧化应激损伤、细胞周期持续进展、细胞在宫腔外不断复制增殖,从而促进内异症的发展。本研究旨在阐明缺氧及其相关分子(HIF-1α、miR-210-3p等)在内异症异位病灶形成、生长中的具体作用机制及寻找内异症治疗的潜在靶点。目的:明确在内异症异位病灶形成中起关键作用的Integrins及其与缺氧的关系。方法:(1)收集15例非内异症患者的正常增生期子宫内膜,15例行宫腹联合手术的内异症患者的异位病灶和同期的在位子宫内膜,通过免疫组织化学(immunohistochemistry assay,IHC)分析标本中HIF-1α及Integrins的表达情况;(2)收集13例月经周期的增生期行宫腔镜手术的内异症患者的在位子宫内膜,提取内异症在位子宫内膜间质细胞(eutopic endometrial stromal cells,ESCs),建立稳定的内异症原代间质细胞提取、纯化、鉴定、编号及培养体系;(3)对新鲜提取的13例ESCs(编号为:ESC-1、ESC-2、ESC-3、ESC-4、ESC-5、ESC-6、ESC-7、ESC-8、ESC-9、ESC-10、ESC-11、ESC-12、ESC-13)进行常氧(21%O2)、缺氧(1%O2)处理及细胞粘附能力、迁移能力分析;(4)提取缺氧处理0、48小时后的ESCs的m RNA和蛋白进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)及免疫印迹分析(western blot,WB),检测缺氧对HIF-1α及Integrins表达的影响。结果:(1)IHC结果表明:与正常增生期子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对的增生期在位子宫内膜的上皮细胞、间质细胞中均异常高表达HIF-1α,但仅间质细胞中特异性高表达整合素家族中的Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5;(2)功能实验表明:缺氧培养显著提高ESCs的粘附能力、迁移能力;(3)缺氧培养增加ESCs中HIF-1α、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的m RNA和蛋白表达。结论:HIF-1α在内异症异位病灶的间质细胞和上皮细胞中表达升高,且异位病灶间质细胞上Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的特异性高表达参与了ESCs的异位粘附和异位病灶的形成,缺氧培养可能通过上调整合素的表达促进ESCs的粘附能力,但缺氧上调Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的具体机制不明。目的:探索缺氧促进ESCs异位粘附的具体机制及小鼠内异症模型的异位病灶形成初期HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达情况。方法:(1)IHC检测内异症患者异位病灶及在位内膜中TGF-β1、TGF-β受体2(TGF-βreceptor II)的表达情况;(2)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测缺氧培养后13种ESCs细胞上清液中TGF-β1的表达情况;(3)常氧培养时添加TGF-β1、缺氧培养下添加TGF-β1特异性抑制剂(SB431542),利用粘附实验、Transwell迁移实验检测TGF-β1对ESCs粘附能力、迁移能力的影响;(4)RT-q PCR,WB,免疫荧光(Immunofluorescence assay,IF)检测经典的TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路激活情况;(5)SB431542预处理、HIF-1α的特异性RNA干扰病毒感染细胞后,通过RT-q PCR,WB检验HIF-1α在TGF-β1/Smads信号通路激活及整合素表达上调中的作用;(6)通过将内异症患者增生期的在位子宫内膜组织植入8周龄的雌性C57BL/6小鼠腹腔,构建11只小鼠内异症模型,在植入0、48小时后取出病灶并通过IHC检测异位病灶中HIF-1α、TGF-β1、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的表达情况。结果:(1)IHC结果表明:TGF-β1及TGF-βreceptor II在内异症患者异位病灶间质细胞中显著高表达;(2)缺氧培养显著增加ESCs中TGF-β1蛋白的分泌;(3)IF结果表明:缺氧培养ESCs促进p-Smad2由细胞浆进入细胞核,且缺氧处理后4小时、8小时,p-Smad2蛋白在核内表达明显升高;(4)WB结果显示:缺氧培养下p-Smad2,p-Smad3,Smad4及整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的蛋白表达均增加;(5)TGF-β1特异性抑制剂SB431542有效抑制Smads信号通路的激活,且显著降低缺氧上调的整合素水平;敲降HIF-1α显著抑制缺氧培养下TGF-β1的分泌、Smads信号通路的激活及整合素表达的上调;(5)动物实验的IHC结果表明,异位病灶形成初期(内膜植入48小时),子宫内膜间质细胞中HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达均增加,与体外实验结果一致。结论:缺氧刺激ESCs分泌TGF-β1,TGF-β1与TGF-βreceptor II结合后磷酸化Smad2、Smad3,增加p-Smad2入核,激活p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路,进而增加下游整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的表达及ESCs的粘附能力,且此过程依赖于HIF-1α。目的:评估缺氧环境对内异症细胞DNA的影响,明确缺氧标志性miRNA-210-3p在内异症患者异位病灶中的定位和表达情况。方法:(1)收集27例非内异症患者来源的正常增生期子宫内膜、57例配对的内异症异位病灶和同期在位子宫内膜,IHC检测组织中HIF-1α和氧化应激诱导的DNA损伤标志蛋白8-OHd G的表达情况;(2)对新鲜提取的另外5例原代ESCs(编号为ESC-14、ESC-15、ESC-16、ESC-17、ESC-18)及购买的人子宫内膜腺癌上皮细胞系Ishikawa进行缺氧培养,利用单细胞凝胶电泳实验(碱性彗星实验)检测缺氧处理0天、28天后ESCs和Ishikawa的DNA双链损伤情况;(3)对缺氧处理后的原代ESCs进行高通量测序,筛选出显著变化的micro RNAs并进行RT-q PCR验证;(4)通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridisation analysis,FISH)和免疫荧光双染色检测5例正常增生期子宫内膜组织、5例配对的异位病灶、在位内膜组织,明确miR-210-3p在异位病灶中的定位情况;再通过RT-q PCR对15例正常增生期子宫内膜组织,15例配对的异位病灶、在位内膜组织中miR-210-3p的表达情况进行定量分析。结果:(1)IHC结果表明:与正常子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对在位子宫内膜的上皮细胞及间质细胞中均异常高表达8-OHd G,且趋势与HIF-1α的表达情况一致,提示内异症细胞存在DNA损伤,且缺氧可能参与了该过程;(2)碱性彗星实验结果显示:缺氧培养28天显著增加彗星的尾长(Tail length)、彗星尾部荧光强度(Tail DNA%)及彗星尾矩(Tail olive moment),说明慢性缺氧诱发了ESCs和Ishikawa的DNA损伤;(3)高通量测序及组织RT-q PCR结果表明:缺氧培养显著上调ESCs和Ishikawa中miR-210-3p的表达水平,且内异症患者异位病灶组织中miR-210-3p的表达也显著高于在位内膜和正常子宫内膜;(4)FISH及免疫荧光双染色结果显示:异位病灶中高表达的miR-210-3p定位于子宫内膜的间质细胞和上皮细胞。结论:慢性缺氧是诱发内异症细胞氧化应激性DNA损伤的原因之一,但内异症细胞逃逸氧化应激压力,持续在宫腔外存活、增殖的机制不明,异位病灶间质细胞和上皮细胞中显著高表达的miR-210-3p可能通过表观遗传调控参与了该过程,但是具体机制有待探究。目的:探索缺氧上调的miR-210-3p在内异症细胞逃逸氧化应激性DNA损伤及异位存活、增殖中的作用及具体分子机制。方法:(1)在常氧、缺氧培养下,利用慢病毒特异性敲除miR-210-3p,并对ESCs和Ishikawa进行细胞增殖实验、流式细胞检测(Flow cytometric analysis,FCM)及WB,分析miR-210-3p在常氧、缺氧环境下对细胞增殖及细胞周期分布的影响;(2)为减少原代ESCs带来的个体差异,先对商品化的人子宫内膜异位症在位子宫内膜永生化间质细胞系h EM15A进行miR-210-3p的过表达,然后进行高通量测序、生物信息学分析及双荧光素酶报告基因分析(Luciferase assays)以寻找miR-210-3p参与的主要生物学过程和miR-210-3p的靶基因;(3)利用RT-q PCR、WB等技术验证靶基因BARD1及其下游效应蛋白BRCA1在过表达、敲降miR-210-3p的ESCs及Ishikawa中的表达情况;(4)对第三部分中验证miR-210-3p表达情况的15例正常增生期子宫内膜、15份配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜进行RT-q PCR分析,并对15份异位病灶组织中miR-210-3p和BARD1 m RNA的表达水平进行相关性分析;(5)IHC检测27例正常增生期子宫内膜、57对配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜中BARD1和BRCA1的表达情况;(6)常氧、缺氧培养下敲降miR-210-3p或过表达BARD1,利用WB分析下游功能分子BRCA1、p-BRCA1、p53,p21,Cyclin B1及Cdc2的表达情况,并利用流式细胞术分析缺氧条件下miR-210-3p、BARD1对细胞周期分布的影响。结果:(1)缺氧培养下敲降miR-210-3p导致ESCs和Ishikawa发生细胞周期的G2/M期阻滞,且使缺氧上调的Cyclin B1、Cdc2蛋白及缺氧下调的p53、p21蛋白水平得到恢复,但常氧培养下敲降miR-210-3p对细胞周期分布、细胞周期调节蛋白无影响;(2)高通量测序、生物信息学及荧光素酶报告基因分析显示:过表达miR-210-3p影响h EM15A的细胞周期调控过程,如有丝分裂、染色体定位、细胞分裂、微管运动、纺锤体和着丝点微管组装等;软件预测和Luciferase assays结果证明miR-210-3p通过直接结合BARD1的3’-UTR区域靶向抑制BARD1的表达;(3)RT-q PCR及WB结果表明:过表达miR-210-3p下调ESCs及Ishikawa中BARD1的m RNA表达,干扰miR-210-3p则增加BARD1的m RNA表达,且过表达和敲降miR-210-3p后BARD1、BRCA1在蛋白水平上表现出与BARD1 m RNA一样的变化趋势;(4)IHC结果表明:异位病灶、在位内膜的间质细胞及上皮细胞中BARD1的表达均显著低于其在正常增生期子宫内膜中的表达;RT-q PCR结果显示异位病灶组织BARD1的m RNA表达与组织中miR-210-3p的表达显著负相关;(5)WB和功能实验结果表明:缺氧抑制的BRCA1蛋白表达能被miR-210-3p的干扰病毒逆转,BARD1过表达则能逆转BRCA1蛋白在miR-210-3p过表达的ESCs和Ishikawa细胞中的表达下降,且缺氧条件下过表达BARD1导致G2/M期阻滞,BRCA1、p-BRCA1、p53、p21表达升高,Cyclin B1、Cdc2蛋白表达下降。结论:缺氧虽诱发内异症细胞的DNA损伤,但缺氧上调的miR-210-3p又能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的泛素化降解,扰乱DNA损伤修复复合物BRCA1/BARD1发挥正常的细胞周期检测点功能,使细胞周期不阻滞,内异症细胞逃逸氧化应激压力而持续在宫腔外生长、增殖。目的:利用小鼠内异症模型研究miR-210-3p抑制剂、抗氧化剂维生素C(Vitamin C)在体内对异位囊肿生长的作用。方法:(1)构建50只C57BL/6小鼠子宫内膜异位症模型:每天根据体重用200ug/kg雌激素处理供体鼠7天,将供体鼠双侧子宫沿其最长轴切开,并剪成0.5×0.3cm大小,然后将子宫内膜面贴紧肠系膜缝入去势后的8周龄受体C57BL/6小鼠腹腔,术后隔天给予200ug/kg雌激素维持,直至4周后实验结束;(2)随机选取16只内异症小鼠,均分为两组,利用体内传送系统(in vivo-jet PEI?delivery agent)将对照组试剂(Negative control,NC)、miR-210-3p抑制剂(In-210)注射入小鼠腹腔,4周后取出异位病灶,测量病灶体积,IHC分析BARD1、BRCA1在异位病灶的间质细胞和上皮细胞中的表达情况;(3)剩余33只内异症小鼠随机分三组,每组11只,PBS组正常饲养,隔日腹腔注射等体积PBS(约100u L),口服维生素C组(OIVC组)将饮用水更换为2.5g/L维生素C水溶液,维生素C注射组(IPIVC组)根据小鼠体重隔天腹腔注射500mg/kg维生素C并正常给予饮水和食物;4周后取出异位病灶,测量病灶体积;IHC分析HIF-1α、8-OHd G、BARD1及BRCA1表达情况。结果:(1)同种异体移植法能有效构建小鼠子宫内膜异位症模型,成功率为49/50,且异位病灶可见典型的子宫内膜间质细胞和上皮细胞;(2)利用in vivo-jet PEI?delivery agent体内敲降miR-210-3p显著缩小内异症模型中异位病灶的体积,且增加BARD1、BRCA1蛋白在异位病灶间质细胞和上皮细胞中的表达;(3)抗氧化剂Vitamin C口服、腹腔给药均能抑制小鼠内异症模型异位病灶的生长,IHC结果显示腹腔注射Vitamin C显著抑制异位病灶间质细胞和上皮细胞中HIF-1α、8-OHd G蛋白的表达,增加间质细胞和上皮细胞中BARD1、BRCA1蛋白表达。结论:体内敲降miR-210-3p可能通过上调内异症细胞中BARD1蛋白表达,引起BRCA1蛋白的累积,激活DNA的损伤修复,从而抑制内异症细胞周期进展和异位病灶的生长;而抗氧化剂Vitamin C腹腔注射不仅增加BARD1、BRCA1蛋白表达,也有效抑制异位病灶中HIF-1α及8-OHd G的表达,提示维生素C可能通过减轻异位病灶整体的氧化应激水平,恢复氧化/抗氧化平衡,抑制异位病灶的生长,抗氧化剂为内异症的临床辅助治疗提供了新的思路。