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研究背景和目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染约占全球人口的一半,但只有少部分的感染者发病。现已明确,Hp是慢性胃炎、消化性溃疡、胃MALT淋巴瘤和胃癌的致病因子。在正常胃黏膜中,胃上皮细胞增殖和凋亡保持动态平衡,而Hp感染能打破这一平衡,并与感染结局及致病多样性密切相关。目前有关Hp导致胃上皮细胞凋亡增殖的研究中,结论很不一致,甚至相互矛盾。许多体内研究表明Hp感染既可促进胃上皮细胞凋亡,又可诱导细胞增殖,从而加速了细胞的更新,认为和其诱导的免疫炎症反应和代偿性增生有关。许多体外研究报道Hp能直接诱导胃上皮细胞凋亡,但也有研究认为Hp主要是刺激胃上皮细胞增殖,并能在早期直接激活细胞增殖信号通路,促进DNA合成增加,从而使细胞恶变风险增加。目前体外研究所选用的大多是不同类型的胃癌上皮细胞,而这些胃癌细胞本身在凋亡、增殖信号传导等方面已存在异常。不同浓度的Hp和作用时间长短的影响也不同,这可能是结果不一致的原因之一。在细胞凋亡增殖的调控中,Akt-Mdm2-p53通路发挥重要作用。Akt促进细胞增殖和抗细胞凋亡,它磷酸化Mdm2,使Mdm2稳定和可更有效地转位到核内,通过泛素化途径降解p53蛋白而下调p53功能,使细胞能抗衡p53介导的凋亡。而Mdm2也是p53的一个靶基因,可被p53负反馈调控。同时,p53可通过上调PTEN,而发挥间接抑制Akt的作用。因此,Akt-Mdm2-p53信号通路在决定细胞凋亡或增殖中扮演重要角色,而它在Hp致病中的作用尚不清楚。因此,针对以上研究现状,本课题研究不同阶段胃黏膜病变中Akt-Mdm2-p53信号通路相关蛋白的表达和Hp感染的关系；同时进行体外实验研究,选用来源于人正常胃上皮细胞的GES-1细胞为实验对象(预试验提示能表达野生型p53),研究Hp培养滤液对GES-1细胞凋亡增殖的直接影响及和Akt-Mdm2-p53信号通路的关系,为探讨Hp的致病机制提供理论和实验依据。方法：1、收集Hp阳性和阴性的慢性非萎缩性胃炎(CNAG)、化生性萎缩(MA)、异型增生(Dys)和胃癌(GC)胃黏膜病理标本,行Akt-Mdm2-p53信号通路相关蛋白的检测。2、制备NCTC11637Hp标准菌株培养滤液,测定浓度为11.1mg/ml,以此为初浓度,稀释不同的浓度,和GES-1细胞共培养,设立只加Hp培养液的对照组,根据实验在不同时间点收集细胞行相应检测。3、Akt信号通路的阻断：加40umol/L的LY294002预处理GES-1细胞1h,设立加40umol/L的DMSO为对照组。4、相应指标的检测：(1)病理标本Hp感染检测：采用Giemsa染色法检测。(2)病理标本蛋白的检测：应用免疫组化PV-9000法检测。(3)细胞形态学检测：倒置显微镜和电镜观察。(4)细胞活力的检测：采用四唑蓝(MTT)比色试验检测。(5)细胞周期的检测：采用PI染色流式细胞术方法检测。(6)细胞凋亡的检测：采用DNA电泳和Annexinⅴ/PI双染色流式细胞术检测。(7)DNA损伤检测：采用单细胞凝胶电泳检测。(8)细胞mRNA的检测：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测。(9)细胞蛋白的检测：采用Western blotting方法检测。结果：1、不同胃粘膜病变中Hp感染和Akt-Mdm2-p53信号通路表达的关系(1)在CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病变中分别行Hp阳性者和Hp阴性者比较,pAkt在CNAG组的Hp阳性者显著高于Hp阴性者(P<0.05)；Akt在各粘膜病变中均无显著性差异(P>0.05);Mdm2在Dys组Hp阳性者显著高于阴性者(P<0.05)；突变型p53在MA组Hp阳性者显著高于阴性者(P<0.05)；PCNA在Dys组Hp阳性者显著高于阴性者(P<0.05)；Bax在CNAG、MA组阳性者显著高于阴性者(P<0.05),其余各组无显著性差异(P>0.05)。(2)在Hp阳性的CNAG、MA、DYS和GC各粘膜病变中,Akt、pAkt在各病变组的表达无显著差异(P>0.05)。Mdm2、PCNA蛋白的表达在GC、Dys组显著高于CNAG、MA组(P<0.05),Bax蛋白的表达在MA组最高,显著高于CNAG、Dys、GC组(P<0.05)(3)在Hp阳性的CNAG、MA、Dys胃粘膜病变中,对pAkt、Mdm2、突变型p53、Bax和PCNA蛋白的表达行相关性分析,pAkt和Mdm2,Mdm2和PCNA的表达呈正相关(P<0.05)。2、Hp培养滤液对GES-1细胞生物学行为的影响(1)形态学变化：Hp培养滤液作用GES-1细胞后48h内电镜和倒置显微镜下观察,细胞呈现典型的空泡化、凋亡改变,且随Hp培养滤液浓度的增加和作用时间的延长而加重。(2)1：4浓度Hp培养滤液作用GES-1细胞48h后行DNA电泳,结果DNA条带呈凋亡特征性梯状改变,而对照组无此改变。(3)MTT检测Hp培养滤液作用GES-1细胞后的增殖活性：在3h、6h和12h时间点,各浓度组的细胞存活率和照组比较均无显著性差异(P>0.05)。作用24h,各浓度组的细胞存活率显著低于对照组(P<0.05),但各浓度组间无显著性差异(P>0.05)。作用48h,1：4、1：2浓度组的细胞存活率(74.7±12.1%,62.2±12.6%)均显著低于对照组(100.0±8.3%)(P<0.05),且呈浓度依赖性。但对照组与1：8组之间无显著性差异(P>0.05)；作用72h时,1：8、1：4、1：2、1：1组的细胞存活率显著低于对照组(P<0.05),且呈浓度依赖性,均有显著性差异(P<0.05)。行1：·8浓度的Hp培养滤液作用GES-1细胞80天后,和平行传代的对照组比较,细胞存活率显著增加。(P<0.05)(4)流式细胞仪分析显示：1：4浓度的Hp培养滤液作用GES-1细胞48h后,细胞周期主要阻滞在G0-G1期(98.73±1.12%vs45.37±4.89%),凋亡率显著上升(26.93±5.34%vsl.65±0.44%)(P<0.05)。(5)单细胞凝胶电泳检测DNA损伤：1：4浓度的Hp培养滤液作用GES-1细胞3h后,和对照组比较,彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例无显著性差异(P>0.05)；作用48h后,彗星尾部DNA量显著增加。(P<0.05)。3、Akt-Mdm2-p53信号通路在Hp培养滤液对GES-1细胞影响中的作用(1)Hp培养滤液作用GES-1细胞后p53、Mdm2、Bax mRNA的表达：1：4浓度的Hp培养滤液作用GES-1细胞48h,p53 mRNA无显著变化(P>0.05)；Mdm2 mRNA、Bax mRNA的表达显著上调(P<0.05)；(2)Hp培养滤液作用GES-1细胞后Akt-Mdm2-p53通路相关蛋白水平及活性的变化：1：4浓度的Hp培养滤液作用GES-1细胞不同时间后,Akt蛋白无明显变化,pAkt在1h后上升,在3h达最高峰,在48h内持续升高,Mdm2蛋白具有类似变化趋势；p53蛋白12h内无明显变化,在24、48h上升；Bax蛋白在1h后上升,48h内持续升高。(3)加入Akt抑制剂LY294002处理GES-1细胞后,用1：4浓度的Hp培养滤液作用细胞,与未加入抑制剂比较,12h和24h的细胞存活率显著下降(P<0.05)。在作用24h后pAkt、Mdm2蛋白表达显著下降(P<0.05),而p53蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论：1、Akt-Mdm2-p53信号通路参与了Hp感染相关的胃黏膜病变发生、发展,在Hp感染导致的CNAG、MA、Dys病变阶段中起作用,而在胃癌病变阶段中与Hp感染无明显关系,提示Akt-Mdm2-p53信号通路主要在Hp致癌的早期阶段起作用。2、在短期作用下,Hp培养滤液可导致胃上皮细胞凋亡,活力下降,DNA损伤,且呈浓度和时间依赖关系；在低浓度培养滤液长期作用下,Hp能诱导胃上皮细胞增殖活性升高。3、Hp可同时激活凋亡和增殖信号通路。在早期,Hp通过激活Akt和诱导Mdm2的表达对抗Hp诱导的凋亡作用,使p53水平无明显变化。但在细胞DNA损害加重时,Hp激活p53通路促进细胞凋亡和使细胞阻滞在G0/G1期。在Hp感染时阻断Akt通路可使Hp对细胞的抑制作用加重,Mdm2蛋白下调,p53蛋白上调。因此,在Hp作用的不同时期,Akt-Mdm2-p53信号通路根据细胞的损害程度共同调控细胞的存活或死亡,在Hp致病中起重要作用。