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草莓(Fragaria × ananassa Duch.)属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,为世界范围内广泛栽培、多用于鲜食的水果。其果实因富含营养物质(如维生素C,维生素A,花青素等),风味独特、香甜,以及颜色鲜艳受到广大消费者的喜爱。花青素不仅是一种重要的抗氧化物质,对人体有重要的保健功能,而且是草莓果实颜色形成的主要原因,是评判果实外观品质的核心指标,直接影响着果实的商品价值。因此,增加果实中花青素的含量,成为了草莓育种者和栽培者追求的目标。自然界中不同颜色草莓果实尤其是浅色(如黄、白色)材料的存在,为探索草莓果实花青素积累机制提供了良好机会,并在研究中得到了应用,但都局限于野生二倍体森林草莓或五叶草莓中,且大都集中于对已知的花青素合成和调控相关基因或转录因子的研究,而对栽培的八倍体草莓花青素合成与调控的研究甚少、尤其是在草莓自身的花青素合成与调控的新基因挖掘方面的研究还鲜见报道。本研究选用遗传背景一致的红肉(’红颜’)和白肉(’小白’)八倍体栽培草莓,利用组学、生物信息学以及基因功能验证对草莓中花青素的调控关键和网络进行了研究。主要研究内容和结果如下:1.采用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)方法测定八倍体红肉草莓’红颜’和白肉草莓’小白’5个发育成熟阶段果实表皮和果肉中两种主要花青素苷(天竺葵3葡萄糖苷:Pelargonidin 3-glucoside,Pg3G和矢车菊素3葡萄糖苷:Cyanidin 3-glucoside,Cy3G)含量变化。结果显示,’红颜’果实果肉中仅有Pg3G积累,且其含量随着果实发育成熟过程逐渐增加;’小白’果实果肉中无花青素苷积累。’红颜’和’小白’果实表皮中Pg3G和Cy3G均有积累,其中Pg3G含量约为Cy3G的2-3倍,且’红颜’果实表皮中花青素苷含量高于’小白’果实表皮中的含量。2.利用同源克隆方法从’小白’草莓果实中克隆出花青素苷合成酶(Anthocyanin synthase,ANS)基因 并采用实时定量(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法对其在’红颜’和’小白’果实中的表达量进行测定,然后通过农杆菌介导的方法,在’小白’果实中瞬时过表达FaANS对其进行功能分析表明,FaANS在’小白’果实果肉中表达水平远低于其在’红颜’果实果肉中的表达量,并且过表达FaANS后的’小白’果实较对照无明显的表型变化,表明过表达FaANS不能恢复’小白’果实中花青素苷的积累。3.利用RNA测序(RNA sequencing,RNAseq)技术对’小白’和’红颜’白果和全红期果实果肉进行高通量深度转录组测序,并对其花青素苷合成相关基因和调控因子的表达模式进行分析发现,与’红颜’相比,几乎所有花青素苷合成途径中关键酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT)的表达水平在’小白’中均受到抑制,而F3’H由于其在’小白’和’红颜’中的表达量极低,在两个品种草莓中的表达水平无明显差异。转录因子MYB1R在’小白’中上调,WD40在’小白’中显著下调。4.利用HPLC方法对’红颜’和’小白’果实发育过程中的抗坏血酸(Ascorbicacid,AsA)进行测定发现,高花青素苷含量的’红颜’含有高AsA水平。并基于RNAseq数据,利用生物信息学方法对其代谢通路基因表达进行分析发现,这种差异主要是通过对D-葡萄糖醛酸途径的调控造成。在’小白’中,该途径中关键酶基因PME、PG以及GalUR的表达水平均较其在’红颜’中的表达量显著下降。此外,与’红颜’中的表达水平相比,’小白’中蔗糖合成关键基因表达也受到抑制,但生长素、赤霉素以及乙烯信号途径中的关键基因(如AUX/IAA、GA20ox、ERF等)的表达均有所增强。5.基于RNAseq数据,利用生物信息学方法对草莓中花青素苷相关的长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)进行筛选鉴定发现,草莓中有50,601个转录本为可能的lncRNAs。与’红颜’相比,’小白’中分别有19个和12个lncRNAs在白果期显著下调或上调;49个和20个lncRNAs在红果期显著下调或上调,6个lncRNAs在红果和白果时期均下调以及4个lncRNAs在红果和白果时期均上调。对草莓中已知的小RNA(microRNA,miRNA)进行前体及靶基因预测发现,130个lncRNAs可能作为80个miRNAs的前体,其中仅有1个lncRNA在’小白’和’红颜’中的表达水平存在差异;392个miRNAs靶向60个差异表达的lncRNAs,说明lncRNAs主要是通过作为miRNAs的靶基因参与花青素苷的调控。通过lncRNAs及miRNAs前体与靶基因互作构建了 lncRNAs参与草莓花青素苷的调控网络。6.通过同源克隆方法从草莓果实中克隆出FaMYB1O基因,利用农杆菌介导的方法在’小白’和’红颜’果实中进行过量表达FaMYB10发现,过表达FaMYB10后的’小白’果实表型发生明显变化,由白色果肉变为红色果肉;在过表达FaMYB10后的’红颜’果实中,果实表皮和果肉的颜色均较对照变深。利用HPLC方法测定表明,FaMYB10过表达后的’小白’和’红颜’果肉中均恢复了 Cy3G的积累,而在果实表皮中Cy3G含量较对照明显增加。利用qPCR方法对过表达FaMYB10的’小白’果实果肉中花青素苷相关基因及调控因子表达水平进行检测表明,在过表达果实中花青素苷合成关键基因CHS、CHI、DFR、F3’H、ANS和UFGT表达量均显著上升,其中F3’H基因在正常生长条件下的’红颜’和’小白’中几乎不表达,但在过表达果实中其表达量显著增加,说明FaMYB10可能对其表达进行调控,从而使过表达果实中花青素苷Cy3G恢复积累。