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【目的】 构建用于检测外源71型肠道病毒(Human enterovirus71,EV71)的稳定细胞系,并对其检测方法的特异性和敏感性进行评价。 【方法】 1.用含有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的EV71感染性cDNA克隆pWSK-EV71-GFP作为分子模板,缺失EV71的4个结构蛋白和7个非结构蛋白基因,扩增出基因片段5-UTR+ GFP+2A Recognition sequence+3-UTR+PolyA,以真核表达载体pcDNA3.1(+)为骨架,经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切后,构建用于EV71检测的缺陷型真核表达质粒pcDNA3.1-△EV71-GFP。用脂质体转染法以质粒pcDNA3.1-△EV71-GFP转染BHK-21细胞,转染后6h,细胞感染EV71,同时用感染同为正链 RNA病毒的甲病毒属辛德毕斯病毒( Sindbis Virus, SINV-XJ-160)、黄病毒属乙脑病毒(Japanese encephalitis Virus,JEV-P3)的细胞组做对照,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况。 2.为了构建基于缺陷型复制子的EV71检测细胞系,将方法1中扩增出的基因片段5-UTR+ GFP+2A Recognition sequence+3-UTR+ PolyA克隆到慢病毒载体pLV-Puro的多克隆位点(multiple cloning site,MCS),制备EV71启动序列修饰的、含有GFP报告基因的慢病毒表达质粒pLV-GFP。使用脂质体转染法将质粒pLV-GFP和包装质粒Helper共转染HEK293T细胞,48h后收集感染细胞的上清液。用收集的慢病毒颗粒再感染BHK-21细胞,并经嘌呤霉素压力筛选获得阳性多克隆细胞株。经96孔板系列稀释法二次筛选后,获得生长状况良好的单克隆细胞株,用作EV71检测细胞系的候选株。经功能鉴定获得可用于 EV71检测的工程细胞系 BHK/GFP。用BHK/GFP细胞分别感染辛德毕斯病毒、乙脑病毒感染做对照,根据荧光蛋白的表达情况来评价检测方法的特异性。用BHK/GFP细胞感染不同稀释滴度的EV71,观察GFP的表达情况,来评价检测方法的灵敏性。 【结果】 1.转染缺陷型复制子pcDNA3.1-△EV71-GFP的BHK-21细胞在感染EV71后,可以观察到特异的绿色荧光,空白对照组细胞则无绿色荧光蛋白表达,表明缺陷复制子转染的BHK-21细胞可用于外源EV71的检测。同时,转染缺陷型复制子的BHK-21细胞感染辛德毕斯、乙脑病毒等单股正链RNA病毒后均未观察到绿色荧光,提示本检测方法具有良好的特异性。 2.慢病毒工程载体pLV-GFP和包装质粒Helper共转染HEK293T细胞后收集慢病毒颗粒,并经转染、压力筛选及系列稀释后成功获得EV71检测细胞系的单克隆细胞株BHK/GFP。BHK/GFP细胞感染EV7148h时可观察到绿色荧光,说明此细胞系可以用于EV71检测。与之相比,对照组的BHK/GFP细胞感染辛德毕斯病毒、乙脑病毒后均未观察到绿色荧光,提示以此细胞系为基础的EV71检测方法特异性良好。BHK/GFP细胞感染滴度为10 PFU/mL(Plaque forming units,PFU)及以上的EV71后,可观察到特异的绿色荧光。而BHK/GFP细胞感染滴度为1 PFU/mL的EV71后则不能观察到绿色荧光。表明BHK/GFP检测细胞系的灵敏系为1~10 PFU/mL。 【结论】 本研究所构建的EV71检测细胞系BHK/GFP可用于外源EV71的检测,且该检测方法具有良好的特异性和灵敏性。