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【目的】 构建用于检测外源71型肠道病毒（Human enterovirus71，EV71）的稳定细胞系，并对其检测方法的特异性和敏感性进行评价。 【方法】 1.用含有绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因的EV71感染性cDNA克隆pWSK-EV71-GFP作为分子模板，缺失EV71的4个结构蛋白和7个非结构蛋白基因，扩增出基因片段5-UTR+ GFP+2A Recognition sequence+3-UTR+PolyA，以真核表达载体pcDNA3.1（+）为骨架，经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切后，构建用于EV71检测的缺陷型真核表达质粒pcDNA3.1-△EV71-GFP。用脂质体转染法以质粒pcDNA3.1-△EV71-GFP转染BHK-21细胞，转染后6h，细胞感染EV71，同时用感染同为正链 RNA病毒的甲病毒属辛德毕斯病毒（ Sindbis Virus， SINV-XJ-160）、黄病毒属乙脑病毒（Japanese encephalitis Virus，JEV-P3）的细胞组做对照，在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况。 2.为了构建基于缺陷型复制子的EV71检测细胞系，将方法1中扩增出的基因片段5-UTR+ GFP+2A Recognition sequence+3-UTR+ PolyA克隆到慢病毒载体pLV-Puro的多克隆位点（multiple cloning site，MCS），制备EV71启动序列修饰的、含有GFP报告基因的慢病毒表达质粒pLV-GFP。使用脂质体转染法将质粒pLV-GFP和包装质粒Helper共转染HEK293T细胞，48h后收集感染细胞的上清液。用收集的慢病毒颗粒再感染BHK-21细胞，并经嘌呤霉素压力筛选获得阳性多克隆细胞株。经96孔板系列稀释法二次筛选后，获得生长状况良好的单克隆细胞株，用作EV71检测细胞系的候选株。经功能鉴定获得可用于 EV71检测的工程细胞系 BHK/GFP。用BHK/GFP细胞分别感染辛德毕斯病毒、乙脑病毒感染做对照，根据荧光蛋白的表达情况来评价检测方法的特异性。用BHK/GFP细胞感染不同稀释滴度的EV71，观察GFP的表达情况，来评价检测方法的灵敏性。 【结果】 1.转染缺陷型复制子pcDNA3.1-△EV71-GFP的BHK-21细胞在感染EV71后，可以观察到特异的绿色荧光，空白对照组细胞则无绿色荧光蛋白表达，表明缺陷复制子转染的BHK-21细胞可用于外源EV71的检测。同时，转染缺陷型复制子的BHK-21细胞感染辛德毕斯、乙脑病毒等单股正链RNA病毒后均未观察到绿色荧光，提示本检测方法具有良好的特异性。 2.慢病毒工程载体pLV-GFP和包装质粒Helper共转染HEK293T细胞后收集慢病毒颗粒，并经转染、压力筛选及系列稀释后成功获得EV71检测细胞系的单克隆细胞株BHK/GFP。BHK/GFP细胞感染EV7148h时可观察到绿色荧光，说明此细胞系可以用于EV71检测。与之相比，对照组的BHK/GFP细胞感染辛德毕斯病毒、乙脑病毒后均未观察到绿色荧光，提示以此细胞系为基础的EV71检测方法特异性良好。BHK/GFP细胞感染滴度为10 PFU/mL（Plaque forming units，PFU）及以上的EV71后，可观察到特异的绿色荧光。而BHK/GFP细胞感染滴度为1 PFU/mL的EV71后则不能观察到绿色荧光。表明BHK/GFP检测细胞系的灵敏系为1～10 PFU/mL。 【结论】 本研究所构建的EV71检测细胞系BHK/GFP可用于外源EV71的检测，且该检测方法具有良好的特异性和灵敏性。