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目的:早期分泌型抗原靶6能够通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制自噬的作用,从而促进卡介苗的生长增殖,研究ESAT6对溶酶体与自噬小体的融合之间的相互作用关系,为EAST6介导的免疫逃逸机制提供实验依据。方法:1.对转染不同时间pCMV-HA-ESAT6质粒的RAW264.7细胞,进行细胞裂解,BCA法测蛋白浓度,蛋白免疫印记(Western Blot)法检测细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。然后对转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA对照质粒和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下的RFP-GFP-LC3-RAW264.7小鼠巨噬细胞,荧光显微镜下记录结果,并用计算机软件计数;进行细胞裂解,用BCA法测蛋白浓度,蛋白免疫印记(Western Blot)法检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。2.对EBSS(Earle平衡盐溶液)以及转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、pCMV-HA对照质粒处理的RAW264.7细胞进行细胞裂解,然后接种于罗琴培养基上,观察BCG的生长情况。然后对转染pCMV-HA-ESAT6重组质粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA对照质粒和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下的RAW264.7小鼠巨噬细胞,进行细胞裂解,接种于罗琴培养基上,观察BCG的生长情况。3.对转染pCMV-HA-ESAT6的小鼠巨噬细胞(RAW264.7),进行细胞裂解,测蛋白浓度,用 Western Blot 的方法检测 LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、p-mTOR、p-70S6K、p62 的蛋白水平。然后用mTOR的抑制剂Torin1和ESAT6共同处理RAW264.7,用LysoTrackerRed染色溶酶体,并用计算机软件计数溶酶体的数量;用蛋白免疫印记法检测p-70S6K、p62、p-mTOR的量;对细胞进行裂解后进行BCG的培养。结果:1.转染ESAT6质粒的RAW264.7细胞随着时间的延长,LC3Ⅱ的水平逐渐增加,对用ESAT6和CQ处理的三组RAW264.7小鼠巨噬细胞,其LC3Ⅱ的量相差不多,组间无统计学意义,但都高于对照组,荧光显微镜结果显示,ESAT6和CQ处理组自噬体数目差不多,但都高于对照组;2.经EBSS处理的BCG的生长较对照组减少,经ESAT6处理的BCG的生长较对照组增加;经CQ以及ESAT6处理的BCG生长都较对照组增加,且三组生长水平差不多。3.经转染ESAT6的RAW264.7细胞,免疫印记结果显示,LC3Ⅱ、p-mTOR、p-70S6K、p62的水平都较对照组增加;经ESAT6和Torin1处理的RAW264.7细胞Western Blot结果显示p62和p-mTOR的量比ESAT6单独处理时减少,LysoTracker Red染料法结果显示在Torin1单独存在或与ESAT6共同存在时,恢复了 ESAT6单独处理时所致的染色减少;BCG结果显示在Torin1单独存在或与ESAT6共同存在时,BCG的生长情况都较ESAT6单独处理时减少。结论:本研究说明了 MTB分泌型毒力因子ESAT6(早期分泌抗原靶6)可以通过诱导mTOR的激活,抑制溶酶体与自噬小体的融合,从而抑制自噬流量,并能够促进巨噬细胞内BCG的增值。