丙型肝炎是丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。据世界卫生组织统计,全世界约有1.7-2亿人被HCV感染,占世界总人口的3%。HCV一旦感染即呈现高度慢性化致病过程,约75%～85%急性丙型肝炎的患者可发展为慢性丙型肝炎,大约5%的慢性丙型肝炎患者最终会发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。人和黑猩猩是HCV的自然宿主,由于稳定高效的HCV体外培养体系和合适小动物模型的缺乏,使得HCV感染与致病的机制研究受到较大限制。树鼩因其体型小,繁殖快,易于饲养和新陈代谢及解剖学特性接近人类而受到研究者们的重视。近年来,有许多研究表明树鼩可以被HCV感染,成为研究HCV感染的潜在小动物模型。原代肝细胞的分离培养则是建立HCV体外感染模型及应用基础研究的关键,但目前树鼩原代肝细胞的分离培养尚不稳定,方法上有待进一步优化。另外,病毒对细胞的感染的受体结合环节,是决定病毒感染的宿主嗜性和组织嗜性的主要因素,对受体的研究也有助于阐明HCV致病机理,并为HCV治疗药物及疫苗的研究提供理论依据。本论文首先采用两步灌流法分离树鼩原代肝细胞,在分离过程中比较Hepes、D-Hank’s和PBS三种缓冲液的灌流效果,发现D-Hank’s作为第一灌流液时分离效果最佳;比较600-1200 rpm的离心速度情况下的细胞得率发现,最大转速为1000 rpm,最小转速为600 rpm,并且采用降速的方式离心能够得到活力最高和数量最大的细胞;在培养细胞过程中观察非实质细胞生长情况,并对血清(FBS),ITS及葡萄糖等添加量进行比较,发现,添加2%FBS、1×ITS和1%葡萄糖时能够维持树鼩原代肝细胞最佳生长条件,最终培养天数可达40天以上。在优化分离培养条件下,利用MTT及EDU染色技术对细胞的增殖情况进行了测定,发现树鼩原代肝细胞得率、培养细胞生长状态都有了很大提高,为后期的HCV感染实验奠定了基础。在实现树鼩原代肝细胞高质量培养的基础上,采用Huh7.5.1细胞系培养的病毒滴度为107 ffu/ml的J6/JFH1病毒进行感染。经MTT法确定最佳的感染复数为1.5,并用该感染复数对树鼩原代肝细胞进行感染实验;感染上清采用逆转录巢式PCR方法进行定性检测,可检测到培养上清中HCVRNA,荧光定量PCR检测上清中最高病毒载量可达6X 104copies/ml。利用Western Blot方法检测树鼩原代肝细胞中HCV蛋白表达,可间歇检测到HCV蛋白的表达,证实HCV蛋白可以在树鼩肝细胞中表达。此结果初步表明树鼩原代肝细胞可以被HCV感染,并支持其复制,但存在因病毒批次与宿主个体差异等因素所致病毒感染不稳定问题。最后,利用普通PCR方法,从实验室原有质粒PLIVE-CD81上扩增了 CD81基因片段,扩增长度为709 bp,通过双酶切、连接的方式将CD81片段连接至带有绿色荧光蛋白的PIRES2-EGFP载体上,构建了 CD81的重组质粒,并完成了核苷酸序列的测定。将构建的能够表达绿色荧光蛋白且携带人的受体基因CD81的质粒,采用脂质体转染的方式在树鼩原代肝细胞中进行表达,转染后48h采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,并用实时荧光定量PCR准确的检测出转染后表达量较转染前提高了 5倍。表达人CD81后的树鼩原代肝细胞再次用J6/JFH1进行感染,感染复数为1.5,同时设未转染的细胞作为对照,培养上清用荧光定量PCR方法检测到转染后的细胞上清中较未转染的细胞有一定提高了一个数量级。表明CD81的表达对树鼩原代肝细胞的感染性有一定的影响。综上所述,本论文以实验室人工驯化和繁育的树鼩,采用两步灌流法分离树鼩原代肝细胞,经优化条件后培养的树鼩原代肝细胞生长状态良好,,为后续试验打下基础。用J6/JFH1感染的树鼩原代肝细胞通过定性,荧光定量PCR,蛋白水平检测后,均证实树鼩原代肝细胞对HCV具有一定的感染性。将人CD81在树鼩原代肝细胞中表达后并感染HCV,通过与未表达CD81的细胞比较,证实CD81对HCV感染树鼩原代肝细胞有一定的影响。