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本论文研究工作首先对13种含有不饱和内酯环或α,β-不饱和酮结构、且母核各异的中药活性成分进行体外抗多药耐药肿瘤活性筛选,并根据体外活性筛选结果确定昆明山海棠为后期药效物质基础研究的药材。对昆明山海棠药材进行提取分离以及化合物的鉴定,同时对昆明山海棠中的主要活性成分--雷公藤甲素的抗多药耐药肿瘤的作用机制进行初步研究。研究主要包括以下几个部分:一、文献研究 查阅文献,对中药活性成分逆转或抗多药耐药肿瘤活性以及昆明山海棠的化学成分、药理活性以及临床研究进展进行了综述。二、中药活性成分的体外抗多药耐药肿瘤活性筛选采用MTT比色法,选取MCF-7/Adr、Bel7402/5-Fu、A549/Taxol这3种多药耐药肿瘤细胞,检测13个中药活性成分(分别为葛根素、野黄芩苷、蛇床子素、补骨脂素、地高辛、人参皂苷Rg3、大黄素、姜黄素、雷公藤甲素、10-羟基喜树碱、鬼臼毒素、氧化苦参碱、番荔枝内酯)的体外抗多药耐药肿瘤活性。结果表明10—羟基喜树碱和雷公藤甲素对3种耐药肿瘤细胞株均具有很好的抑制作用,而鬼臼毒素、地高辛和番荔枝内酯除了对肺癌耐药细胞株的抑制作用不明显之外,对另外2种耐药细胞株具有较好的抑制作用,其他活性成分的效果不是很明显。三、雷公藤甲素抗多药耐药肿瘤肺癌细胞的作用机制初探前期对这些中药活性成分的体外活性筛选结果表明,雷公藤甲素(TPL)对肺癌耐药细胞株A549/Taxol具有很好的杀伤作用,并且现有文献对其作用机制研究未见报道,因此对雷公藤甲素的抗多药耐药肿瘤的作用机制进行初步研究,为今后雷公藤甲素的开发利用提供一定的参考。使用流式细胞仪检测给药雷公藤甲素后A549/Taxol多药耐药细胞的凋亡情况和细胞周期变化,同时测定cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化;通过共同给药TPL和MAPKs抑制剂初探雷公藤甲素在抑制A549/Taxol多药耐药细胞生长过程中JNK、p38 MAPK、ERK1/2、AKT在其中发挥的作用,再结合蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测p-ERK1/2、p-JNK、p-P38 MAPK、p-AKT以及p-GSK 3β蛋白表达水平的变化,确定MAPK通路是否参与TPL诱导A549/Taxol多药耐药细胞凋亡。结果表明,雷公藤甲素抑制耐药肺癌细胞增殖48h时的IC50为46.47±0.31nM,远好于阳性药顺铂的8.87±0.98μM,后续实验选用的药物浓度为0.025、0.05μM。MTT实验结果发现,SB202190对细胞增殖的影响很小,而SP600125和U0126分别对耐药细胞产生协同和拮抗作用。由此表明JNK和ERK1/2通路雷公藤甲素抑制A549/Taxol耐药肺癌细胞增殖可能与调节JNK和ERK1/2通路有关。流式细胞术分析结果发现,雷公藤甲素能使耐药肺癌细胞阻滞在S期;并且分别用0.025、0.05μM浓度的TPL作用后,A549/Taxol耐药肺癌细胞的凋亡率分别达到8.50%、24.45%,相比于空白组的3.48%,凋亡率明显上升。本研究还发现cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表达明显增加,以及Bax/Bcl-2的表达也显著上调,由此验证了流式细胞术中检测到TPL诱导A549/Taxol凋亡的结果。同时通过对MAPKs通路和AKT通路中关键蛋白的检测结果表明,雷公藤甲素可能是通过上调ERK通路和下调JNK和AKT通路来诱导A549/Taxol耐药肺癌细胞凋亡的。四、昆明山海棠成分研究 根据前期的化合物活性筛选,选择抗耐药肿瘤活性最好的化合物——雷公藤甲素为目标化合物。查阅相关文献,选择雷公藤甲素含量较高且国内外研究较少的同属植物昆明山海棠进行后续的化学成分分离。用醇提水沉法昆明山海棠药材进行提取,并对水不溶部分(小极性化合物)分别用二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇进行分段。再用这三个部位进行抗肺癌耐药细胞A549/Taxol的活性筛选,确定其主要活性部位。采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及反相色谱等多种分离技术对昆明山海棠活性部位进行了化学成分分离与纯化,并通过分析波谱数据对分离化合物进行结构鉴定。活性筛选结果发现,二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇部位抗耐药肺癌细胞A549/Taxol 的 ICso分别为 16.02±0.75 μg/ml、72.60±2.51 μg/ml 和 245.8±10.12μg/ml,最终选择CH2C12部位为后续的主要活性部位进行分离。化学成分分离成果:从昆明山海棠根中分离出7个化合物,其中2个为新化合物,3个为首次从该植物中发现的化合物;分别鉴定为β-谷留醇、3’-香叶草基-5,7,2’-5’四羟基异黄酮(首次发现)、3-(2’-甲氧基-4’-二羟基)-5,7-二甲氧基-6-(3-甲基-2-丁烯基)-苯骈吡喃(新化合物)、β-谷甾醇棕榈酸酯(首次发现)、雷公藤甲素、甘油山嵛酸酯(首次发现)和2-(5’,7’-二甲氧基-2’,2’-二甲基-2H-苯骈吡喃-6’-)-3-醛基-5,6-二甲氧基-苯骈呋喃(新化合物)。