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狂犬病是由狂犬病毒(RabiesVirus，RV)引起的人兽共患疾病，目前尚无有效的抗狂犬病毒药物，一旦发病无法医治。因此，研究抗狂犬病毒复制和感染的新方法，探索和开发狂犬病治疗的有效途径具有十分重要意义。1988年Fire率先发现了一种新型的基因阻断技术，即RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术。发现至今，短短数年里，该技术已被广泛用于研究基因功能和基因治疗。2002年，《Science》杂志将其评为当年的世界十大科技进步之首。在病毒学领域里，大量研究证明，采用RNAi技术能有效抑制诸如HIV、HBV和HCV等病毒的复制和感染。但目前尚未发现有关于狂犬病毒RNA干扰的文献报道。
本研究将RNA干扰技术应用于抑制狂犬病毒复制的研究，采用了包括RNA酶Ⅲ消化长片段dsRNA、体外转录和构建质粒在体内转录等不同方法制备小干扰RNA(siRNA)，从病毒感染、基因表达和核酸水平(mRNA)等多方面，比较其对RV的抑制效果。证明用狂犬病毒N基因作为RNAi的靶基因，抑制病毒效果最佳。当siRNA设计序列与靶序列差异不在3端时，对狂犬病毒不同毒株均有较好的抑制效果。本研究共分四个部分，各部分内容和结果如下：1.狂犬病毒的增殖特性和检测方法的研究。
采用一种非常规的方法制备高滴度的狂犬病毒攻击毒。利用持续感染RV的细胞所释放的病毒制备毒种，滴度与常规法相当而方法更为简单。
提出一个新的计量狂犬病毒群体大小的定量单位—FTCID50。相关实验结果证实，该单位和目前国际上最常规的计量狂犬病毒个体的单位—病灶形成单位(FFU)具有稳定的相关关系。
探索开发了一种定量检测狂犬病毒的新方法—用免疫细胞化学方法定量检测狂犬病毒。研究表明，该方法和免疫荧光定量检测方法结果相当和平行。
2.用狂犬病毒核蛋白基因小于扰RNA库抑制狂犬病毒复制和感染的研究采用RNaseⅢ消化长片段双链RNA的方法，制备了RV-N基因、P基因和G基因小干扰RNA库(siRNACocktail)。将不同基因的小干扰RNA库转染BSR和MNA细胞单层后，采用直接免疫荧光法观察发现，N基因小干扰RNA库能够对狂犬病毒的复制和感染产生明显和稳定的抑制作用，并且通过RT-PCR在转录水平探测到mRNA产量的降低；而P基因或G基因小干扰RNA库对狂犬病毒的复制和感染仅产生弱的或不产生抑制作用。研究结果确定了N基因在抑制狂犬病毒复制中的关键作用及选择N基因作为RNAi研究中靶基因的方案。
3.体外转录21nt小干扰RNA抑制狂犬病毒复制的效果观察利用体外转录试剂盒合成了针对狂犬病毒PV株靶基因N基因mRNA上、中、下段不同位点序列的8条21nt小干扰RNA(siRNA)。抑制试验结果表明，21ntsiRNA对RV-PV株的复制具有程度不同的强抑制作用。对RV不同毒株CVS和CTN株攻击下的交叉抑制试验结果表明，在与靶mRNA碱基错配高达5个的情况下仍对异源毒株有相当高的抑制率。然而，siRNA链3端碱基与靶mRNA错配对抑制作用的丧失起关键作用，将导致抑制率的大幅下降，其中3端第二个碱基的错配将导致抑制作用的基本丧失。这一结果为我们提出了RNAi抑制作用的广谱性，偏靶效应及设计更为独特的siRNA序列等议题。
4.质粒介导型siRNA对RV复制的抑制作用从上述8条siRNA序列中挑选两条比较符合要求的序列合成DNA模板插入Genesil1和Genesil2质粒载体，经测序鉴定插入序列正确。将质粒直接转染细胞3天后，绿色荧光蛋白显示转染率高达50％。此时感染狂犬病毒后，shRNA的抑制试验结果表明对狂犬病毒的复制产生了弱的抑制作用，其强度弱于体外转录的21ntsiRNA产生的抑制作用。
本研究首次将RNA干扰技术应用于狂犬病毒研究中，证明小干扰RNA能特异和有效的抑制狂犬病毒复制，为进一步研究狂犬病的治疗奠定了基础。