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目的:研究丙戊酸(VPA)在不同年龄、以及在与酶诱导剂联合用药时肝脏毒副作用差异及其机理,并探讨左旋肉碱(LC)和抗氧化剂防治 VPA 肝毒副作用的疗效与机制。 方法:健康婴儿(生后 21 日龄)及成年 Wistar 大鼠共 112 只行对比研究,以不同剂量 VPA 连续灌胃 30 天,分别设立正常对照组(T0)、小剂量 VPA 组(200mg/kg/d, T1)、小剂量 VPA+PB 组(T2)、大剂量VPA 组(500mg/kg/d, T3)、大剂量 VPA+PB 组(T4)、大剂量 VPA+LC 组(T5)、大剂量 VPA+PB+LC 组(T6)、大剂量 VPA+VitE+辅酶 Q10(CoQ10)组(T7)以及大剂量 VPA+PB+VitE+CoQ10组(T8)等共 9 组。差速离心制备肝线粒体。(1)化学比色法测定肝功酶谱、血脂、血液凝血因子、血氨、L-肉碱、线粒体呼吸酶系及脂质过氧化反应等;(2)高效液相色谱、流式细胞仪、原位杂交方法分别检测 VPA与PB血药浓度、肝线粒体跨膜电位以及肝细胞色素P450还原酶mRNA的表达;(3)采用 Oil-Red-O 染色、HE 及电镜等技术,观察肝细胞及其线粒体形态结构的改变。 结果:(1) 各实验组均获得与临床一致的VPA治疗血浓度,多在52~87.7μg/ml之间,最高未超过160μg/ml。联合PB用药时,VPA浓度平均下降30.88%~47.02%,表明PB加速了VPA在体内的代谢;(2) 无 3<WP=8>重庆医科大学博士学位论文论婴儿或成年鼠,即使大剂量VPA/VPA+PB,对肝功酶谱ALT、AST及CHO、TG、HDL、LDL等血脂均无明显影响,而凝血因子PT、TT、APTT、Fbg,以及血氨和L-肉碱含量均有显著改变。补充L-肉碱改善肝脏凝血因子合成功能、血氨指标,而VitE+CoQ10仅表现出对肝脏凝血因子合成功能的保护; (3) 大剂量VPA/VPA+PB使婴儿鼠肝线粒体细胞色素aa3含量分别下降58.80%和61.80%,成年组分别下降37.55%和46.53%,与对照组比较,差异均非常显著 (P<0.01)。VitE+CoQ10对细胞色素aa3含量有明显保护作用。检测肝线粒体呼吸链关键酶琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)活性表明,仅有大剂量VPA/VPA+PB婴儿鼠SDH活性与对照组存在非常显著性差异(P<0.01),分别降低44.8%和57.9%。婴儿和成年鼠CCO活性均显著降低,且婴儿鼠降低更明显,与对照皆有非常显著差异(P<0.01)。L-肉碱及VitE +CoQ10对SDH和CCO活性均有明显保护作用; (4) 无论婴儿还是成年组,大剂量VPA/VPA+PB动物的肝线粒体GSH含量均显著低于同龄对照组(P<0.01),而线粒体MDA含量均显著增高(P<0.05),婴儿鼠更严重。VitE+CoQ10使GSH和MDA含量维持于正常水平,提示有效阻止了线粒体脂质过氧化进程。L-肉碱对异常GSH和MDA含量无明显改善;(5) 成年各组实验鼠之间肝线粒体膜电位MMP无显著异常。但婴儿鼠中大剂量VPA+PB组下降21.47%,与对照差异显著(P<0.05)。L-肉碱及VitE+CoQ10均有效维护MMP正常; (6) 大剂量VPA引起婴儿鼠肝内P450还原酶mRNA平均光密度值(OD)增加(P<0.05),但对成年 4<WP=9>重庆医科大学博士学位论文鼠无影响。合并使用PB时,则引起各年龄鼠该酶mRNA表达均增强;(7) 肝切片Oil-Red-O和HE染色显示,婴儿大剂量VPA/VPA+PB组均出现门管区为主的肝细胞脂肪变性,脂肪细胞数分别高出成年鼠7.5和12倍,差异非常显著(P<0.01)。L-肉碱或VitE+ CoQ10干预后脂肪变性肝细胞数均有非常显著减少(P<0.01),表明两者皆能有效阻止肝细胞脂肪变性,但VitE+CoQ10的作用不及L-肉碱;(8)虽然肝细胞线粒体功能在大剂量VPA影响下有明显异常,但电镜下未见明显结构改变。 结论:(1)成功制备了婴儿和成年大鼠长时间口服 VPA 的动物模型,其稳态血浓度与临床治疗血浓度一致;(2)证实婴儿期、大剂量或与 PB 等肝酶诱导剂联合用药,是 VPA 诱发肝损伤的重要因素;(3)在 VPA 诱发的肝损伤中,肝细胞线粒体虽无电镜下形态学的明显改变,但其功能明显异常,集中表现为线粒体膜电位和膜通透性异常,呼吸酶系和脂肪酸β-氧化功能障碍,导致体内脂质过氧化增加,血氨浓度增高,蛋白合成功能异常和肝细胞脂肪性变;(4)在 VPA 肝损伤过程中,血氨增高或凝血因子等肝合成功能,较肝酶谱和血脂检测更多见异常;(5)L-肉碱与抗氧化剂对 VPA 肝损伤均有较好防治作用,但前者在提高体内肉碱含量,降低高血氨症和稳定线粒体膜电位效果明显,而 VitE 和 CoQ10则能明显增强肝细胞抗脂质氧化能力。两类药物联合使用,会有更好疗效。