本文参照目前我国近海多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)代表物质之一苯并[α]芘(benzo[α]pyrene, BaP)的真实污染程度,以近海养殖重要经济贝类栉孔扇贝(Chlamysfarreri)为研究对象,筛选了BaP胁迫下性腺差异表达基因,测定了栉孔扇贝性腺及血淋巴性激素含量,探究了多浓度多时间点BaP胁迫下生殖毒性响应关键基因的表达模式,并研究了BaP胁迫对栉孔扇贝卵巢、精巢DNA单链断裂、蛋白质羰基含量、MDA含量影响,最后以组织显微切片的方式验证BaP对栉孔扇贝性腺造成的生殖毒性。得到的具体实验结果如下：1.栉孔扇贝在BaP胁迫下性腺差异表达基因的筛选与分析本实验运用数字基因表达谱技术(Digital gene expression, DGE)根据栉孔扇贝性腺组织对照组和0.5μg/L BaP染毒组10d的DGE数据对比筛选差异表达基因。其中精巢组织对照组与染毒组分别获取12485055和14454127条clean reads,将clean reads与本实验室已提交的栉孔扇贝转录组(SRPO18044) unigene进行拼接比对,比对率分别为74.24%和77.27%；通过数据分析,共筛得差异表达基因1051条,其中上调基因223条,下调基因828条。经GO功能聚类分析显示,差异基因主要涉及芳香族化合物代谢、ATP代谢、免疫防御、细胞凋亡和精子发育、精子分化等功能；KEGG通路分析表明富集显著的代谢通路包括三羧酸循环通路、氧化磷酸化通路、NOD-like受体信号通路、类固醇合成通路等。运用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术,选取9条差异表达关键基因(HSP90、 CYP3A、HGD、CDK2、IAP、TSSK2、PDE5和17HSD、E2SULT)验证了DGE结果的可靠性。卵巢组织对照组和染毒组DGE分别获取13,666,882和14,276,579条clean reads,比对率分别为74.55%和78.46%,共筛得差异表达基因124条,其中上调基因42条,下调基因82条。与苯并芘生殖毒性相关的差异基因主要聚类于解毒代谢、细胞外基质与细胞间相互作用的损伤效应、内分泌干扰效应和组织损伤等效应。由以上看出,栉孔扇贝在BaP胁迫下精巢的解毒代谢、能量代谢和免疫防御等功能发生了变化,引起了细胞凋亡等损伤效应,并干扰了类固醇(性激素前体物质)的合成和精子的形成过程；卵巢的解毒代谢、细胞骨架及性腺发育相关基因的表达水平发生了变化,引起了细胞质基质疏松,造成了损伤效应,并干扰卵巢发育等过程。2.栉孔扇贝在BaP胁迫下生殖内分泌干扰效应的研究本实验将栉孔扇贝暴露于染毒浓度为0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中,分别于0、3d、10d、21d取样,采用酶联免疫试剂盒测定栉孔扇贝精巢卵巢及血淋巴中性激素的含量,采用实时定量PCR技术测定了DGE测序筛得的差异表达的细胞粘连、凋亡相关基因(♀-ITGA9、COL6A3,♂-5IAP、CDK2),性激素合成和性腺发育相关基因(♀-CYP17、3p-HSD.17β-HSD、ER、VTG,♂-CYP17、3β-HSD、 17β-HSD、TSSK2、PDE),研究了BaP胁迫对栉孔扇贝性激素含量的影响,探究了多浓度多时间点BaP胁迫下生殖毒性响应关键基因的表达模式。本研究中BaP胁迫对栉孔扇贝性腺组织和血淋巴三种激素含量均产生了显著影响。在卵巢组织中,BaP显著降低了三种激素含量,且呈时间剂量效应：雌性扇贝血淋巴中,0-3d时,BaP对雌二醇和睾酮含量有诱导升高趋势,随后明显下降,后恢复至或低于对照水平,孕酮含量始终低于对照组水平；在精巢组织中,BaP显著抑制了雌二醇含量,但对睾酮却有诱导其升高作用,显示出一定的雄激素效应,孕酮含量被低浓度BaP诱导升高,被高浓度BaP抑制；而在雄性扇贝血淋巴中,BaP对三种激素含量都有诱导升高趋势,随后各染毒组三种激素含量降低,并显著低于对照组水平。由实验结果可知,在实验期间血淋巴中的性激素水平的变化和性腺中的变化并不完全一致,且精巢和卵巢组织三种激素受BaP的影响也不尽相同。BaP也显著影响了栉孔扇贝性腺解毒代谢损伤响应基因、性激素合成相关基因及性腺发育基因的表达水平,染毒浓度不同造成的影响程度不同,对雌、雄性腺同一基因也呈现出不尽相同的诱导模式,表现出了毒性效应和内分泌干扰效应。3.栉孔扇贝在BaP胁迫下性腺损伤效应的研究本研究将栉孔扇贝暴露于染毒浓度为0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中,分别于0、1d、3d、6d、10d、15d、21d取样,测定碱解旋F值、脂质LPO水平和蛋白质羰基含量鉴定BaP对三大物质造成的影响。研究表明BaP胁迫对栉孔扇贝卵巢、精巢DNA单链断裂、蛋白质羰基含量、MDA含量影响显著。栉孔扇贝性腺组织各染毒组F值在实验期间呈下降趋势,且0.5、2.5μg/L BaP染毒对栉孔扇贝性腺DNA损伤(F值表示)影响显著(P<0.05),呈时间剂量效应。卵巢、精巢各处理组蛋白质羰基含量先升高后降低后反弹并于实验结束时显著高于对照组水平。染毒期间,性腺组织各组MDA含量有逐渐升高趋势,且2.5μg/L BaP染毒组15d时MDA含量均显著高于对照组水平。实验表明,不同浓度的BaP均对栉孔扇贝性腺造成了显著的DNA断裂损伤、脂质LPO与蛋白质羰基化程度的升高。蛋白质羰基含量在染毒期间呈现了明显的应急期和修复期,但最终还是造成了损伤。MDA含量呈波动变化,也表现出了栉孔扇贝对BaP的解毒代谢响应,最终也还是含量显著升高。表明了BaP能通过氧化损伤途径对栉孔扇贝性腺产生毒性作用,随着染毒时间延长均能够得到不同程度的修复,但这种修复在不同浓度BaP处理组之间也存在差异。4.BaP对栉孔扇贝精巢、卵巢显微结构的影响本研究将栉孔扇贝暴露于染毒浓度为0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中,于15和21d时取精巢、卵巢制成组织切片,观察BaP对栉孔扇贝性腺组织的影响。结果发现,相比对照组,随BaP染毒浓度增加,栉孔扇贝卵巢滤泡间出现空隙并呈增大趋势,同时卵母细胞间排列也较疏松,卵母细胞变形且细胞质中也出现空隙,且到21d时,卵母细胞变形严重且出现了退化现象,滤泡壁细胞受损,排列散乱,界限变模糊；栉孔扇贝精巢随着各处理组染毒浓度增加,精巢滤泡内出现空隙并呈增大趋势,精子数量减少,随时间延长,精子间缝隙变大,精子排列无规则,不再呈紧密的辐射状。研究表明BaP能显著影响栉孔扇贝性腺的发育,使得性腺组织滤泡内生殖细胞数量增殖延缓,且能毒害生殖细胞使其变形,排列无序。此外BaP还损伤了性腺组织中滤泡壁的结构,使滤泡壁细胞间质疏松,滤泡壁界限模糊。由此可以看出BaP具有内分泌干扰效应和组织损伤效应。