1.靶向性腺病毒介导的肿瘤自杀基因治疗的应用自杀基因疗法是将病毒或细菌的基因引入肿瘤细胞，利用该自杀基因编码的特异性酶将无毒性药物转化为对细胞有毒性的药物，杀死肿瘤细胞，这是一种有效的肿瘤基因治疗的方式。影响自杀基因疗效的最关键问题就是选择一个合适的载体将自杀基因转导至靶细胞。复制缺陷型腺病毒血清型5(Ad5)是目前肿瘤基因治疗中应用最多的病毒载体。虽然Ad5载体显示了很好的基因转移能力，但细胞表面柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor, CAR)表达量的差异将严重影响病毒的转导效率，因为CAR是Ad5与细胞结合的关键位点，它介导病毒与细胞的结合及细胞对病毒的内吞作用。研究表明很多肿瘤细胞缺乏CAR，因此这将是以Ad5为载体的肿瘤基因治疗面临的一个重要问题。大量研究表明基因改造的方法可提高Ad5在缺乏CAR的肿瘤细胞中的病毒嗜向性，因此这也是一个有潜力的可提高肿瘤自杀基因治疗的策略。研究表明暴露在knob外表面的HI-loop是一个加入外源氨基酸序列的良好位点，但是Ad5全基因组约36kb，很难直接向其中加入只编码几十个氨基酸的碱基序列，因此，本论文中我们希望通过穿梭质粒和特殊的酶切位点，将外源靶向性序列先插入到穿梭载体中，然后通过体外连接就可以将其放入Ad5载体HI-loop中。同时，该Ad5中可引入一个报告基因，用于检测HI-loop中放入靶向性序列后，病毒的转导效率。同时为提高肿瘤自杀基因治疗的效果，可以采用双自杀基因联合应用的方式提高疗效。HSV-TK/GCV系统是最常用的自杀基因系统，它能通过诱导产生有毒性的三磷酸GCV杀死肿瘤细胞，同时可以通过旁观者效应杀死邻近未表达TK基因的肿瘤细胞，但不同的细胞其细胞间隙间隙通讯连接(gapjunctionalintercellularcommunication,GJIC)的能力不同，因此该系统在不同细胞间的旁观者效应具有很大差异。Coli.NTR/CB1954系统则是通过诱导DNA交联的方式快速地杀死肿瘤细胞，它可同时杀伤增殖细胞和非增殖细胞。此外，Coli.NTR基因介导的CB1954代谢产物本身具有膜渗透性，所以Coli.NTR/CB1954系统的旁观者效应不需要依赖于GJIC。因此将HSV-TK/GCV系统和Coli.NTR/CB1954系统在同一个载体中联合应用，两个系统的作用模式可以互相补充，增加对肿瘤细胞的杀伤作用。研究表明人端粒酶逆转录酶(hTERT)只在肿瘤细胞中表达，且hTERT启动子在～90％的肿瘤细胞中活性升高，而在正常细胞中活性极低，因此，为增加肿瘤自杀基因治疗的安全性和特异性，可使用hTERT基因的启动子作为肿瘤特异性启动子调节自杀基因的表达。在本论文中，我们建立了一个简单且易操作的Ad5载体平台，利用该平台将具有靶向性的Arg-Gly-Asp(RGD)基序加入Ad5的HI-loop区域以此增加Ad5的特异靶向性，同时在平台中加入报告基因以检测载体的基因传递能力。结果表明利用该平台得到的Ad-RGD-Luc可显著增加对CAR低表达的肿瘤细胞的转染效率。随后，我们用hTERT启动子调控的双自杀基因HSV-TK和Coli.NTR取代报告基因并用于肿瘤的自杀基因治疗。结果表明与传统的Ad5相比，靶向腺病毒(Ad-RGD-hT-TK/NTR)介导的双自杀基因治疗体外可显著降低肿瘤细胞的存活率，尤其是在CAR低表达而αⅤβ3高表达的肿瘤细胞ZR-75-30中，可将细胞的存活率由48%降低至9.8%。体内实验中，在肿瘤细胞ZR-75-30荷瘤鼠模型中，相比于常规Ad5携带的双自杀基因治疗，使用靶向性腺病毒载体可大幅提高自杀基因疗法的效果，该系统(Ad-RGD-hT-TK/NTR/GCV+CB1954)可在降低前药剂量的同时显著降低肿瘤体积，其体积只是常规病毒组的47.2%，仅是对照组的10.3%。与此同时，荷瘤鼠生存期实验表明相比于常规腺病毒系统，靶向性腺病毒系统可将荷瘤鼠生存期提高约35%。与此同时，肝脏病理切片结果显示Ad-RGD-hT-TK/NTR/GCV+CB1954系统不会对脏脏组织产生损伤。综上所述，这种靶向性腺病毒介导的hTERT启动子调控的双自杀基因治疗策略对CAR低表达的肿瘤的治疗提供了一个有前景的治疗方式。2.甲基硒醇前药与MDV3100在去势抵抗型前列腺癌中联合应用雄激素剥夺疗法(androgen-deprivation therapy, ADT)是治疗晚期和转移型前列腺癌的主要方法。但患者经ADT治疗后，肿瘤会不可逆地发展为去势抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)，这是前列腺癌患者死亡的主要原因。大量数据表明AR信号通路的再活化是引起CRPC的主要原因，这促使了AR靶向性药物的研究开发，这其中包括FDA批准的用于治疗转移性CRPC的第二代AR拮抗剂--MDV3100。MDV3100对AR的亲和性比第一代AR拮抗剂比卡鲁胺高5-8倍，III期临床结果显示MDV3100可延长化疗后CRPC患者的生存时间，但MDV3100延长患者的平均生存期只有4.8个月，且经过一段时期治疗后，大多数在治疗初期对此药耐受良好的患者会对该药物产生耐药性，因此发展一种有效的可提高MDV3100治疗效果的治疗方式是十分必要的。目前已发现多种经AR mRNA可变剪切产生的AR剪切突变体(AR-Vs)。AR-Vs虽缺失配体结合的LBD结构域，但含有具有转录活性的NTD和具有DNA结合功能的DBD结构域，这使得AR-Vs能在缺乏雄激素的条件下，以非配体依赖的方式激活AR转录，显示调节基因表达的持续活性，这也是前列腺癌发展成为CRPC的机制之一。现已在多数CRPC肿瘤样本中检测出AR-Vs。且相比于激素水平正常的前列腺癌，CRPC肿瘤样本中AR-Vs的表达水平明显上升。MDV3100的作用机理是与雄激素竞争性结合AR-LBD,由于AR-Vs中不存在LBD，所以MDV3100极有可能对AR-Vs无效。最新研究表明在内源性表达的AR-FL和AR-Vs的CRPC细胞中AR-Vs不仅可通过持续活性发挥转录调节作用，同时具有AR-Vs特异的转录基因谱可调节AR-Vs特异的靶基因，进而刺激非雄激素依赖的细胞生长。与此同时，研究表明MDV3100在前列腺癌细胞VCaP细胞及LNCaP支系细胞中治疗可促进细胞中AR-Vs的表达。正因为AR-Vs的这些特点，使得MDV3100对AR-Vs无法产生抑制作用，造成CRPC患者对MDV3100产生耐药性。因此，将以AR-Vs为靶向的药物与MDV3100联合应用或许能成为一种可行的克服MDV3100耐药性同时提高MDV3100治疗效果的方式。甲基硒醇是一种具有抗癌作用的甲基硒类化合物的活化代谢产物，研究表明两种甲基硒醇前药，甲基硒酸(MSA)和甲基硒代半胱氨酸(MSC)可在前列腺癌的治疗中发挥作用。已有实验结果表明在前列腺癌细胞中MSA给药3hr后就可检测到AR-FL mRNA表达水平明显下降，而AR mRNA的稳定性却没有降低，这说明AR基因的转录抑制有可能是造成AR mRNA表达降低的原因。因为AR-Vs是由AR基因的剪切突变产生的,但它与AR-FL使用相同的启动子，因此抑制AR基因的转录也就有可能抑制AR-Vs的转录和表达。因为MSC代谢为甲基硒醇的过程需要有活性的β-裂解酶(β-lyase)的参与,而β-裂解酶只在肝脏和肾脏中表达，而在前列腺中不表达，所以MSC只能用于动物体内实验。因此，我们预测MSA和MSC这两种甲基硒醇前药可以下调AR-Vs的表达，进而提高MDV3100治疗效果。本论文证明MSA可在转录起始阶段抑制AR基因的转录和AR启动子的活性，同时抑制AR-Vs的表达及活性，且该抑制作用不依赖于雄激素的诱导。在CRPC细胞中，MSA和MDV3100联合给药不仅可显著抑制AR信号通路，而且能协同地抑制肿瘤细胞的生长。MSA和MDV3100的协同作用不仅体现在表达AR-Vs的细胞中同时也发生在只表达AR-FL的细胞，这可能是两种药物在不同的步骤上阻止AR信号通路作用的结果。此外，外源表达AR-FL或AR-V7可以弱化联合给药抑制肿瘤生长的效果，表明下调AR-FL和AR-Vs是MSA和MDV3100联合给药抑制肿瘤细胞生长的一个非常重要的作用机制。虽然体内实验表明MSA可以下调AR-FL和AR-Vs蛋白的表达及抑制肿瘤生长，但与MDV3100联合用药时，并不能提高二者的抗肿瘤效果。但另一个甲基硒醇前药MSC却能显著提高MDV3100的抗肿瘤效果。体内实验中MSA与MDV3100无联合瘤效果的原因可能是二者之间会发生化合反应，而这种化合反应很可能是由于治疗方案造成的，因为我们将二者在高浓度下混合后再给药，可能造成了二者的结合。尽管如此，本论文的结果依旧表明甲基硒醇类前药可提高MDV3100的抑瘤效果。综上所述，在本论文中，我们首次提出了一个合理设计的可通过联合给药方式提高MDV3100疗效的方案，证明通过甲基硒醇前药可下调AR-FL及AR-Vs的活性进而提高MDV3100的抑瘤效果。我们的研究结果为临床上评估甲基硒醇前药与MDV3100联合用药治疗CRPC提供了强有力的理论依据。