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植物中的硝酸盐还原酶(nitrate reductase，NR)作为限速酶，催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，这一过程在氮代谢中处于关键地位，对植物生长发育、产量形成有重要影响。目前NR基因已经从一系列物种分离得到，尤其是人们发现氯酸盐对表达NR活性的细胞具有毒性作用，能够很容易的对有或无NR活性的细胞进行筛选之后，已经逐步在一些物种中利用NR基因作为选择标记进行转基因研究。目前利用NR基因作为选择标记在真菌和藻类(如衣藻等)应用较多，已有多种真菌和微藻利用NR基因作为选择标记进行了转基因的研究。但有关杜氏盐藻NR基因的克隆及NR基因选择标记的研究尚未见报道。 杜氏盐藻(Dunaliella salina，D．salina)属绿藻门团藻目多睫毛科，是一种生长在海水或盐湖的嗜盐性浮游单细胞真核生物，无细胞壁，呈梨形，胞内有一个大的杯状叶绿体，具双鞭毛，可在水中游动。其耐盐能力强，抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，是迄今所发现的世界上最耐盐的植物之一，正越来越受到人们的关注。除了与光合作用以及抗盐性有关的研究外，最近有关盐藻作为生物反应器的研究也有报道。 盐藻作为生物反应器，具有繁殖速度快、培养简单、营养成分含量高、表达产物下游纯化过程简单等优越性。在利用盐藻生物反应器表达外源基因时，从大量未转化细胞背景中筛选并获得稳定转化子，必须依赖于选择标记基因。目前有关盐藻选择标记的研究较少，主要有除草剂、抗生素等的初步研究，这些选择标记在利用盐藻生物反应器大规模表达外源蛋白时有一定的缺陷，如除草剂本身可能造成一定的环境污染，除草剂抗性基因可能会由于基因漂移式扩散传递至杂草等而导致生态灾难；抗生素抗性基因一方面成本较高，同时可造成环境污染，也可引起人类对这些抗生素产生抗性等等。因此，在盐藻生物反应器的建立过程中，选择合适的选择标记进行转基因研究是迫切而必要的。郑州大学2004年博士论文杜氏盐藻(刀朋口Iiella:a枷a)硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及鉴定 与上述盐藻选择标记相比，NR基因作为选择标记具有下列优越性:1.遗传上比较稳定，转化效率高;2.筛选简单:转化NR基因突变藻株后，在含硝酸盐的培养条件下，转化藻株能够抗氯酸盐毒性，而非转化藻株不能抗氯酸盐毒性，因此通过氯酸盐抗性进行筛选，可以较为容易的得到转化株;3.转化NR基因突变藻株后，非转化株在硝酸盐培养、氯酸盐压力筛选的条件下生长受到限制，因此未转化细胞背景低;4.NR基因为硝酸盐诱导型基因，便于遗传操作;5.硝酸盐本身为植物的氮素营养的主要来源，成本较低，对环境无污染。因此在转基因盐藻研究中，NR基因是更加适合盐藻自身的、安全的选择标记基因，对建立杜氏盐藻遗传转化系统，使外源目的基因在其中稳定表达、生产目的产品具有十分重要的意义。 建立NR基因选择标记是通过克隆NR基因，并将该基因转化NR基因突变株，使突变株恢复野生型活性而建立选择体系。目前杜氏盐藻NR基因营养缺陷型突变藻株的制备及鉴定工作，本研究室正在建立。本论文主要完成杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因选择标记建立过程中NR基因的克隆、表达载体的构建、NR基因完整性的鉴定以及基因枪转化方法的研究，为进一步建立杜氏盐藻NR基因选择标记奠定基础。 实验方法 1.杜氏盐藻NR基因cDNA序列的克隆和序列分析 1.1利用简并引物扩增杜氏盐藻NR基因cDNA片段及序列分析 通过对GenBank上登陆的不同物种NR氨基酸序列进行比较，筛选出在其中具有高度保守性的序列，根据该氨基酸序列设计简并引物，利用PCR的方法扩增得到了杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段，将其插入克隆载体pMD一18，转化大肠杆菌JM109，经氨节青霉素抗性和蓝白斑试验筛选阳性克隆，提质粒酶切鉴定重组质粒。对重组质粒进行基因序列测定，软件分析测序结果。 1.2利用5’RACE的方法扩增NR基因5’上游cDNA片段及序列分析 根据上述简并引物扩增出的杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段，利用5’RACE的方法向5’上游扩增杜氏盐藻NR基因cDNA片段。由于简并引物扩增出的杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段距5’末端较远，因而本研究共采用3次5’RACE方法，最终得到了杜氏盆藻NR基因cDNAS’端全序列。 每次所扩增的cDNA片段插入克隆载体pMD一18，经筛选和鉴定正确的质粒进行测序和序列分析。 1.3利用3’RACE的方法扩增硝酸盐还原酶基因3’下游cDNA片段及序列分析郑州大学2004年博士论文杜氏盐藻(Dunaliella，alina)硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及鉴定测序和序列分析。 1.3利用3’RACE的方法扩增硝酸盐还原酶基因3’下游cDNA片段及序列分析 根据简并引物扩增得到的序列设计基因特异引物1(GsPI)和2(GsP2)，并设计01190(dT)一接头引物和相应的接头引物1和接头引物2。利用01190(dT)一接头引物逆转录mRNA，得到cDNA第一条链，然后利用接头引物1和GSPI进行第一轮PCR扩增，再利用GSPZ和接头引物2进行第二轮PCR扩增。将扩增得到的cDNA片段插入克隆载体pMD一18，转化大肠杆菌JM109，经筛选和鉴定正确的质粒进行测序和序列分析。 1.4杜氏?