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目的:现代医学研究表明,临床上一些常见疾病及危重症病包括高血压,动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）和冠状动脉疾病在内的多种心血管疾病以及肿瘤、糖尿病等疾病的病理生理过程通常伴随内皮功能障碍（endothelial dysfunction）。在调控内皮细胞功能的诸多因子中,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是刺激血管生成（angiogenesis）最强有力的生长因子之一,直接作用于内皮细胞,发挥促细胞增殖和促新生血管生长的作用。VEGF与3种酪氨酸激酶受体,即血管内皮生长因子受体（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3）结合后发挥其生物学作用,介导了细胞迁移、存活、增殖等一系列细胞行为。其中VEGFR-2是介导内皮细胞VEGF功能的主要受体,二者结合之后通过激活VEGFR-2的活性,促进细胞内下游信号分子级联式的磷酸化反应。VEGFR-2活性异常所诱发的内皮细胞生物学行为改变是多种疾病的细胞和分子生物学基础。在影响VEGFR-2活性的诸多调控步骤中,胞吞和受体再循环的动态平衡过程是受体活性调控的关键步骤,影响血管生成和动脉形成（arterogenesis）过程,并与多种心血管疾病和肿瘤血管生成的病理生理过程密切相关。内皮和平滑肌细胞来源的neuropilin样分子（endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule,ESDN）是一类I型跨膜蛋白（type-I transmembrane protein）,最初是在人类冠状动脉和高度转移性肺癌细胞中克隆得到的,其分子内含有一个CUB结构域和一个凝血因子V/VIII同源结构,与Neuropilins结构相似。课题组之前的研究表明,ESDN通过对VEGFR-2活性的调控,促进VEGF介导的内皮细胞生长、迁移、增殖和渗透性增加等多种生物学功能,而ESDN表达下调或缺失则具有相反的效果。但是ESDN作为一种受体调控蛋白,对VEGFR-2胞吞和再循环过程动态平衡调控的分子机制目前尚不清楚。本研究利用培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）siRNA敲低ESDN表达后,通过检测其对VEGFR-2信号途径和与受体再循环标记分子亲和力的变化,初步探讨ESDN调控VEGFR-2胞吞和受体再循环的分子机制;改良体外血管内皮细胞的原代培养技术,以便将来利用培养的小鼠血管内皮细胞进一步验证ESDN对于VEGFR-2功能的调控。方法:1小鼠胸腹主动脉血管内皮细胞的培养方法选取8周龄的WT和Esdn-/-小鼠各3只,75%的酒精对其皮肤进行消毒后,无菌条件下取出小鼠胸腹主动脉,按照基因型不同分开放置,显微镜下剥除血管周围的脂肪组织,剪成宽约1-2 mm的血管环,超净工作台中按照基因型的不同,分别将血管环接种于基质胶（Matrix gel,Corning公司）中,再加入含有100 U/mL肝素（TCI公司,抑制血管平滑肌细胞的生长）的内皮细胞培养基（endothelial cell media,ECM,Science公司）,放入37℃和5%CO2细胞培养箱中培养。2小鼠胸腹主动脉血管内皮细胞的鉴定由于动脉血管中不仅含有内皮细胞,还有平滑肌细胞和成纤维细胞,所以需要对培养出来的细胞进行特异性和纯度的检验。当细胞生长达到对数期的时候,部分细胞玻片培养至玻片上,利用内皮细胞表面特异性抗原CD31进行免疫荧光染色,部分细胞裂解成蛋白裂解液,电泳检测细胞表面特异性受体VEGFR-2的表达情况,检测细胞的特异性;另外收集108个细胞进行CD31的单色荧光染色的流式分析,检测细胞的纯度。3 HUVEC的培养和siRNA敲低HUVEC中ESDN的表达将HUVEC接种在60 mm培养皿中,用含5%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的无抗生素培养基培养,在37℃和5%CO2细胞培养箱中孵育,待细胞达到40%-50%融合时,细胞用20 nmol/L的ESDN siRNA或通用阴性对照（锐博）siRNA转染,操作按照Lipofectamine RNAiMax试剂盒说明进行,转染8小时后,待细胞融合约80%时,将培养液换成不含FBS和抗生素的低糖培养基,饥饿16小时后,分别给予VEGF-AA（10 ng/mL）刺激不同时间（0、5、15、30分钟）,收集细胞,加入细胞裂解液抽提总蛋白,Western blot检测VEGF信号通路的变化。4免疫荧光鉴定ESDN表达调控HUVEC中VEGFR-2和EEA1、Rab5、Rab7、Rab11等胞吞标记蛋白的共定位变化为研究ESDN表达调控HUVEC中VEGFR-2和EEA1、Rab5、Rab7、Rab11等胞吞标记蛋白的共定位变化以及可能的分子机制,培养HUVEC至细胞玻片,应用siRNA敲低ESDN表达后,应用VEGF-AA（10 ng/mL）刺激不同时间（0、5、15、30分钟）时去掉培养基,4%多聚甲醛固定细胞玻片,在同一个细胞玻片上标记VEGFR-2（抗小鼠抗体,SantaCruz公司）和EEA1（抗兔抗体,Cell Signaling公司）,应用二抗（红色荧光Cy3标记羊抗小鼠二抗和绿色荧光F488标记羊抗兔二抗,Lifetechnologies公司）后荧光共聚焦显微镜检测这两种蛋白的定位情况,以同样的方法鉴定VEGFR-2和Rab5、Rab7、Rab11的共定位情况。5免疫共沉淀鉴定ESDN的表达调控HUVEC中VEGFR-2和EEA1、Rab5、Rab7、Rab11的相互作用利用免疫共沉淀的技术进一步验证ESDN的表达调控HUVEC中VEGFR-2和EEA1、Rab5、Rab7及Rab11的相互作用,培养的HUVEC经siRNA敲低ESDN表达后,VEGF-AA（10 ng/mL）刺激不同时间（0、5、15、30分钟）收集蛋白裂解液,与VEGFR-2抗体包被磁珠（Invitrogen公司）共同孵育16小时,免疫印迹检测EEA1、Rab5、Rab7、Rab11的表达,确定ESDN的表达主要影响VEGFR-2与何种胞吞标记分子的相互作用。结果:1.体外培养小鼠主动脉内皮细胞的方法构建成功对于体外原代培养的WT和Esdn-/-小鼠的胸腹主动脉内皮细胞均进行了特异性和纯度检测。Western blot显示细胞表面受体VEGFR-2阳性,免疫荧光结果显示内皮细胞表面特异性蛋白CD31同样显示阳性,流式细胞术结果显示,超过90%的细胞CD31染色呈阳性。最终表明构建的体外的小鼠胸腹主动脉血管内皮细胞原代培养方法成功,可以用于后续实验的小鼠血管内皮细胞培养。2.ESDN表达下调抑制VEGF的信号通路为探讨ESDN缺失与血管增生之间的关系,体外培养HUVEC,siRNA敲低ESDN的表达,血清饥饿后,用VEGF-AA（10 ng/mL）处理不同时间后收集蛋白,Western blot检测VEGFR-2磷酸化水平及其下游信号通路的变化。结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调抑制了VEGF诱导的VEGFR-2的磷酸化活化,在VEGF刺激5分钟时达到峰值。同时对与内皮细胞增殖迁移相关的下游信号分子进行了检测,结果显示,与对照组相比,ESDN表达下调抑制了VEGF诱导的MAPK-ERK1/2和p38的磷酸化的活化,二者都是在VEGF刺激5分钟时达到其峰值。这一结果表明,ESDN表达下调可能通过抑制VEGF诱导的VEGFR-2的磷酸化,进而抑制下游相关信号分子MAPK-ERK1/2和p38的磷酸化。3.ESDN表达下调促进了胞浆中VEGFR-2与Rab5的相互作用,同时抑制了胞浆中VEGFR-2与Rab11的相互作用为进一步研究ESDN表达下调对VEGFR-2磷酸化以及其下游信号分子MAPK-ERK1/2和p38磷酸化水平抑制的机制,siRNA敲低HUVEC的ESDN的表达,血清饥饿后,VEGF-AA（10 ng/mL）处理不同时间点,分别用免疫荧光技术和免疫共沉淀技术对VEGFR-2和细胞质基质中与囊泡转运相关的蛋白EEA1、Rab5、Rab7以及Rab11进行了共定位研究。结果显示,与对照组相比,无论是否下调ESDN表达,在VEGF刺激时间点时均未检测到EEA1、Rab7与胞浆中VEGFR-2之间的共定位变化。ESDN表达下调后,VEGF刺激5分钟,促进了胞浆中VEGFR-2与Rab5的结合,同时抑制了胞浆中VEGFR-2与Rab11的结合,使VEGFR-2滞留在胞浆中发生去磷酸化,最终抑制VEGFR-2重新返回到细胞膜的过程。结论:1.成功改良了小鼠胸腹主动脉血管内皮细胞的原代培养方法;2.ESDN表达下调抑制血管内皮细胞VEGF信号通路;3.ESDN表达下调促进了胞浆中VEGFR-2与Rab5的结合,同时抑制了胞浆中VEGFR-2与Rab11的结合,使VEGFR-2在胞浆中积累,发生去磷酸化,最终抑制VEGFR-2重新返回到细胞膜的过程。