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阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病,其主要临床症状为进行性认知功能减退,并伴有行为及精神的异常。AD的主要病理学特征是大脑皮质和海马区域的细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)、细胞外老年斑(senile plaques,SP)形成以及神经元缺失(neuronal loss),其中老年斑的主要成分是β淀粉样蛋白(A β),神经原纤维缠结的主要成分是过度磷酸化的微管结合蛋白(Tau蛋白)。AD确切的发病机理尚无定论,其假说纷纭,包括基因学说、传染病学说、炎症学说、胆碱能系统学说、铝中毒学说、自由基学说、钙超载学说、Tau蛋白学说、β-淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)级联假说等。其中Aβ级联假说是现在最为公认的AD发病机制之一。该假说持有的观点是,A β异常聚集是A β级联通路的关键环节,而目前A β代谢通路也是开发AD治疗药物最受关注的靶点之一。在AD的近年研究中,金属离子代谢平衡对Aβ聚集的影响受到广泛关注。其中有研究表明,金属离子内稳态失衡及金属硫蛋白-3(metallothionein-3,MT3)的表达降低与AD的发生发展有着密切的联系[3]。目的:初步揭示当归芍药散对于铜离子代谢平衡及MT3表达的调控机制,探寻当归芍药散对AD治疗作用的新靶点,为中药复方防治AD提供新的思路和实验依据。方法:一、体外实验1.当归芍药散及Cu2+对Aβ的抑聚与解聚作用。应用硫磺素T(Thioflavin T,ThT)荧光染色法分别进行当归芍药散和Cu2+对Aβ的聚集及解聚实验。2.当归芍药散拮抗A β的神经毒性实验。MTT法分别检测A β对SH-SY5Y细胞活力的影响、Cu2+对Aβ神经毒性的影响,以及用当归芍药散干预后其对于SH-SY5Y细胞的保护作用。3.当归芍药散对MT3表达和A β聚集的影响实验。免疫蛋白印迹(Western blot)法检测当归芍药散对A β损伤的SH-SY5Y细胞MT3表达以及胞内胞外A β聚集的影响。二、体内实验1.当归芍药散对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响。7月龄雄性快速老化小鼠(SAMP8)随机分为AD模型组、DSS低剂量组、DSS高剂量组;同月龄雄性抗快速老化小鼠(SAMR1)作为正常对照组;DSS低剂量组、DSS高剂量组给药剂量分别是3.2g/Kg d、6.4g/Kgd,正常组和模型组给予等量dd·H20灌胃,每天一次,4周后,通过Morris水迷宫实验测试各组小鼠学习记忆能力。2.当归芍药散对SAMP8小鼠氧化应激水平的影响。试剂盒检测小鼠大脑皮质丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)含量以及总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。3.当归芍药散对SAMP8小鼠脑内MT3表达以及Aβ水平的影响。荧光定量PCR和Western blot分别从基因和蛋白水平检测小鼠皮质MT3的表达;Western blot检测皮质Aβ水平。4.当归芍药散对SAMP8小鼠脑内铜含量的影响。石墨炉原子吸收分光光度计(atomic absorption spectroscopy,AAS)分别检测小鼠血清及脑组织中铜含量。结果:(一)当归芍药散及Cu2+对Aβ的抑聚与解聚作用当归芍药散不能抑制A β的聚集,但是可以促进纤维态的A β解聚;Cu2+具有抑制Aβ聚集的能力,但不能促进纤维态的Aβ解聚。(二)当归芍药散拮抗Aβ的神经毒性研究当归芍药散水提液浓度在1.25‰、2.5‰和5‰时对A β损伤的SH-SY5Y细胞均有保护作用,能明显提高细胞活力;Cu2+能够增加Aβ的毒性,且当归芍药散药物浓度在2.5‰、5‰和10‰时,对(Cu2+Aβ)共同损伤的SH-SY5Y细胞有保护作用。(三)当归芍药散对MT3表达和Aβ代谢的影响模型组与正常组比较,其MT3蛋白表达量没有明显减少,说明Aβ对SY5Y细胞MT3蛋白表达量没有明显影响;Aβ以多种分子量的形式存在于细胞内,与模型组相比,各用药组胞内Aβ 42蛋白条带呈现条带增粗和颜色变深,且分子量较大的A β含量较多;而胞外的Aβ主要以分子量较小的形式存在,与模型组相比,各用药组胞外Aβ蛋白减少。(四)当归芍药散对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响当归芍药散能明显缩短SAMP8小鼠的逃避潜伏期(P<0.05)。说明当归芍药散能够在一定程度上改善SAMP8小鼠的空间学习记忆能力。(五)当归芍药散对SAMP8小鼠氧化应激水平的影响当归芍药散能显著提高SAMP8小鼠SOD活力;降低其脑内MDA含量(P<0.01;P<0.01)。说明当归芍药散能够减轻SAMP8小鼠的氧化应激损伤。(六)当归芍药散对SAMP8小鼠脑内MT3以及Aβ水平的影响。模型组MT3蛋白在皮质的表达较正常组明显减少(P<0.05),当归芍药散能增加SAMP8小鼠脑皮质内MT3的表达(P<0.01);在A β的表达水平上,模型组和正常组没有明显差异。(七)当归芍药散对SAMP8小鼠脑内铜含量的影响。各组小鼠大脑皮质中铜含量没有明显差异;各组小鼠海马中铜含量差异显著,SAMP8小鼠海马内铜的含量比正常组增加(P<0.05),与模型组相比,当归芍药散低、高剂量组海马内铜含量减少(P<0.05)。结论:1、当归芍药散能明显减轻A β导致的SH-SY5Y细胞损伤;2、Cu2+能够增加Aβ的毒性;3、当归芍药散能在一定程度上改善SAMP8小鼠的空间学习记忆能力;4、当归芍药散能减轻SAMP8小鼠的氧化应激损伤;5.当归芍药散能降低SAMP8小鼠海马内铜含量的升高。