急性B细胞性白血病（B系ALL）是儿童血液系统最常见的恶性肿瘤，目前的主要治疗方法是抗肿瘤药物的联合化疗。尽管化疗有效，但它们在杀伤恶性肿瘤细胞的同时对正常细胞也可造成不同程度的伤害。靶向治疗是近年代开发的一种新的治疗方法，具有重要的临床应用前景。作为靶向治疗的制剂，免疫毒素具有独到的优势，它是一组人工构建的具有特异性杀伤靶细胞能力的杂合分子，由靶向部分（载体）和毒性部分（弹头）组成。靶向部分可以分为两类：一类是单克隆抗体；另一类是某些具有重要生理功能的受体或配体，如生长因子、细胞因子、淋巴因子和多肽激素等。毒性部分是一些具有很强细胞杀伤能力的物质，通常是蛋白毒素，包括植物毒素和细菌毒素；此外毒性部分还可以是放射性同位素、小分子药物等。与化疗比较，免疫毒素只杀伤表达靶分子的细胞，而不损伤无靶分子表达的血细胞和组织器官细胞成分。因此开展免疫毒素的肿瘤靶向治疗研究具有重要的意义。CD19分子是一个B细胞系特异的表面分化抗原，在B系ALL中的阳性率达99.1％（115／116），在髓系细胞、红系细胞、T细胞和骨髓干细胞以及非造血器官组织细胞上无表达，因此CD19抗原是B系ALL靶向治疗的良好靶点。ZCH-4-2E8（简称2E8）是本实验室自行研制并经国际鉴定和命名的新的抗人CD19单克隆抗体。采用2E8抗体作为先导分子进行靶向杀伤研究具有重要的应用前景。研究发现，斑蝥具有极强的细胞毒性作用，临床直接应用研究发现斑蝥制剂对恶性肿瘤有相当的治疗效果，但由于其直接应用缺乏选择性，严重阻碍了其在临床上的推广。以单抗作为先导分子，将斑蝥毒性成分耦合到抗体制成免疫毒素，可能可以避免其非特异性细胞毒性引起的全身毒副作用。以往的研究表明斑蝥的主要药用成分是斑蝥素，系单萜烯类物质，其本身分子结构的特点造成现有的方法很难将它与单抗相连制成免疫毒素。此外，斑蝥素不溶于冷水，仅微溶于热水和溶于丙酮、氯仿等有机溶剂，其脂溶性特性给免疫毒素研制过程带来困难，有机溶剂会使抗体蛋白变性致使免疫毒素失效。所以很有必要研究除斑蝥素之外的水溶性的斑蝥毒性成分，探索这些毒性成分能否采用比较简便的方法将它们耦合到抗体分子上而发挥靶向杀伤白血病细胞的作用?本研究将2E8抗体与斑蝥水溶性毒性物质（简称BM）相连，研制成2E8-BM免疫毒素（简称2E8-BM），并对该免疫毒素选择性杀伤白血病细胞的作用进行了研究，为今后靶向治疗用免疫毒素型药物的研制奠定基础。材料与方法1细胞复苏和培养：按照常规方法复苏2E8、Nalm-6和K562细胞，常规条件下以RPMI 1640+20％灭活小牛血清培养，悬浮生长，每隔2～3天换培养液1次。2流式细胞仪间接免疫荧光法检测Nalm-6和K562细胞的CD19抗原表达情况：取Nalm-6细胞和K562细胞，以PBS洗涤1次，每管加入5×10⁵个细胞；阴性对照管加入PBS 50μl，测试管加入2E8培养上清50μl，4℃反应20min；加PBS离心（1000rpm×10min）洗涤2次，分别加入2μl的GAM-FITC，4℃反应20min；同上PBS洗涤2次，弃去上清，加入200μl PBS重悬细胞，采用流式细胞仪和CellQuest软件收集并分析10000个细胞。3 BM对Naml-6细胞和K562细胞的杀伤作用3．1斑蝥生理盐水浸出液（BM母液）的制备：称取斑蝥虫干体1g，置于小烧杯中，加10ml生理盐水，剪碎碾磨，并浸泡24h；24h后先用普通滤纸粗过滤去渣，再在超净台里用0.22μm的微孔滤器过滤除菌，滤至无菌15ml离心管中，4℃保存。3．2方法：以每孔10⁵个细胞接种于24孔培养板，补加培养液使每孔体积为1800μl，每浓度组做3个复孔。各孔分别加入不同浓度的斑蝥生理盐水浸出液200μl使其终浓度为1:1600～1:100，生理盐水（NS）对照组加生理盐水200μl。最终培养体系每孔为2000μl。将培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。分别于培养24h、48h、72h三个时间点，用倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态及形态学特点，照相记录；用台盼蓝拒染法计数活细胞，并绘制生长曲线。4 BM热稳定性的检查：生长曲线法检测100℃水浴5分钟处理后的斑蝥生理盐水浸出液对K562和Naml-6细胞的杀伤作用。5 BM分子大小的分析：用透析袋（MWCO 10k）透析斑蝥生理盐水浸出液来判断其所含毒性物质的分子大小（大于或小于10kDa）。5．1透析斑蝥生理盐水浸出液：BM 1:40装在透析袋（MWCO 10000）里用生理盐水透析，4℃不断搅拌下透析24h，中间换液两次。透析完成后用0.22μm滤膜过滤除菌保留液。5．2细胞培养：每孔10⁵个细胞接种于24孔培养板，补加培养液使每孔体积为1800μl。分三组：生理盐水组、BM组、透析后的BM组，每组做3个复孔。各组分别加入生理盐水、BM 1:40、透析后的BM 1:40各200μl。将培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。分别培养24h、48h、72h时，镜下观察细胞的状态和用台盼蓝拒染法计数活细胞。6 2E8-BM对Nalm-6和K562细胞的杀伤作用6．1制备2E8和BM的连接产物2E8-BM：取BM（1:200）与2E8杂交瘤细胞培养上清等体积混匀（BM的终浓度为1:400），同样做3管分别于4℃、室温（25℃）和37℃孵育24小时；24h后用生理盐水透析24h；然后用超滤离心管（100,000NMWL）浓缩2E8-BM，浓缩10倍；浓缩完成后分别过滤除菌。6．2流式细胞仪间接免疫荧光法检测连接产物2E8-BM识别CD19抗原的活性。6．3实验分组：生理盐水（N．S．）组、2E8组、BM组、2E8-BM免疫毒素组。6．4细胞培养：每孔10⁵个细胞接种于24孔培养板，补加培养液使每孔体积为1800μl，每浓度组做3个复孔。各组分别加入不同的溶液各200μl，故最终每孔体积为2000μl，起始细胞密度为0.5×10⁵个／ml。将培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。分别培养24h、48h、72h、96h时，用倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态及形态学特点；用台盼蓝拒染法计数活细胞。6．5 Annexin V FITC-Kit检测2E8-BM对Nalm-6细胞的杀伤机制：荧光素标记的连接素V／碘化丙碇（Annexin V-FITC／PI）染色和操作步骤按试剂盒说明书进行，1小时内用流式细胞仪检测分析。7统计方法：全部数据采用SPSS13.0统计软件处理；数据以均值±标准差（（?）±SD）表示；采用单因素方差分析（Dunnet法、LSD法）来比较各组之间的差异，P≤0.05有显著统计学意义；采用Probit回归计算药物的IC50。结果1、Nalm-6和K562细胞的CD19抗原表达情况：2E8单抗与Nalm-6细胞的阳性反应率为99.56％，平均荧光强度（MFI）为261.29；而2E8单抗与K562细胞不反应，阳性表达率仅为1.32％，MFI为43.80。2、BM的细胞毒作用及其相关生物学特性：斑蝥生理盐水浸出液里存在水溶性毒性物质（BM），BM对Nalm-6细胞和K562细胞都有杀伤作用，说明有普遍性细胞杀伤，而无选择性靶向杀伤作用；BM的细胞杀伤作用存在时效、量效关系；作用72h时，Nalm-6细胞的IC50为1:805，K562细胞的IC50为1:689；BM具有热稳定性，100℃水浴5min处理对其毒性作用没有影响，可以初步排除该毒性物质为蛋白质的可能性；BM（1:400）透析保留液组的细胞生长曲线与生理盐水组基本一致，说明BM可以被MWCO为10k的透析膜透析掉，即BM分子量小于10kDa，也说明后续的实验用透析的方法除去2E8-BM里游离的BM是可行的。3、不同温度条件下BM耦合2E8抗体蛋白后对2E8识别CD19抗原的影响：2E8和BM（1:400）在4℃、25℃、37℃不同温度条件下的孵育产物2ES-BM对CD19抗原都具有识别能力，其中25℃、37℃时的孵育产物不影响其对CD19抗原的识别（其识别能力与上清接近），而4℃时的孵育产物对CD19抗原的识别能力相对较差。4、2E8-BM对CD19+Nalm-6细胞的作用：未经偶合的单纯2E8抗体组对细胞的生长无明显影响，与生理盐水对照组比较，各时间点的活细胞数的差异均无统计学意义（P＞0.05）；单纯BM组与生理盐水对照组比较各时间点的差异均有统计学意义（P＜0.05），活细胞数明显减少，孵育至96h细胞全部死亡；不同温度孵育的2E8-BM组与生理盐水对照组比较，48h时差异均无统计学意义（P＞0.05），而96h开始，活细胞数比对照明显减少（P＜0.05），96h和144h时的抑制率都约为50％；经LSD检验，不同温度孵育的2E8-BM组之间在各时间点的活细胞数差异均无统计学意义（P＞0.05）。5、2E8-BM对CD19-K562细胞的作用：单纯2E8抗体组、不同温度孵育的2E8-BM组对细胞的生长均无明显影响，与生理盐水对照组比较，各时间点的活细胞数的差异均无统计学意义（P＞0.05）；单纯BM组与生理盐水对照组比较各时间点的活细胞数的差异均有统计学意义（P＜0.05），活细胞数明显减少，孵育96h后细胞全部死亡；经LSD检验，不同温度孵育的2E8-BM组之间的各时间点的差异都无统计学意义（P＞0.05）。6、2E8-BM对Nalm-6细胞的杀伤机制：用流式细胞仪Annexin V-FITC／PI双染法检测凋亡细胞，结果表明，与生理盐水对照组比较，2E8-BM组的Nalm-6细胞凋亡明显，说明凋亡机制参与了2E8-BM对Nalm-6细胞的杀伤作用结论1．斑蝥生理盐水浸出液中含有极强的非特异性细胞毒性成分；该毒性成分具有热稳定性，游离的毒性成分能用透析的方法除去；2．斑蝥生理盐水浸出液中的毒性成分能采用直接孵育法将其与抗体蛋白耦合，但耦合效力尚有待于提高；3．成功研制2E8-BM免疫毒素；该免疫毒素对CD19+白血病Nalm-6细胞具有良好的靶向杀伤作用，而对CD19-白血病K562细胞的生长却没有影响，提示其临床应用的潜在前景；细胞凋亡机制参与了2E8-BM对Nalm-6细胞的杀伤作用；进一步提高耦合效力和保持抗体识别抗原的能力值得进一步深入研究。