论文部分内容阅读
背景与目的肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）在肿瘤进展中起着重要作用。以往多认为M1型巨噬细胞能够抑制肿瘤生长,但也有研究表明其具有促肿瘤作用。M1型巨噬细胞在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中的促癌作用仍需进一步探究。本研究评估了 M1型巨噬细胞条件培养基（conditioned medium from M1,M1-CM）对OSCC细胞（SCC25和CAL27）增殖、迁移、侵袭和体内成瘤的影响,同时探讨了生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）及其下游信号通路在此过程中的作用。材料与方法1.M1型巨噬细胞对OSCC细胞生物学行为及体内成瘤效应的影响本研究通过筛选癌症基因组图谱数据库（the cancer genome atlas,TCGA）数据库中OSCC转录组测序数据,采用quanTIseq算法评估OSCC的免疫细胞组分,同时将浸润数据和临床特征信息结合分析。体外实验中利用脂多糖（LPS）极化诱导THP-1细胞并鉴定巨噬细胞表型。以基础培养基（basic media,BM）作为空白对照组（含10%FBS的RPMI 1640）,以M1-CM（M1型巨噬细胞培养液上清与BM等体积混合）为实验组培养细胞,通过CCK-8实验、细胞单克隆实验、EdU实验和凋亡实验检测M1-CM对OSCC细胞增殖的影响;采用Transwell实验检测M1-CM对OSCC细胞迁移和侵袭的影响。体内实验通过异种移植瘤实验检测M1-CM和M1型巨噬细胞对OSCC细胞成瘤的影响。2.M1型巨噬细胞促癌的作用机制使用TCGA数据库分析GDF15在OSCC发病或临床预后中的潜在意义及其与M1型巨噬细胞浸润得分的相关性。体外实验中,在经erb-b2受体酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2,ErbB2）抑制剂处理与未经处理的情况下,通过蛋白质印迹（western blotting）检测 M1-CM 刺激后的 SCC25 和 CAL27 细胞中 ErbB2/P13K/AKT 和ErbB2/MAPK/ErK信号通路的表达情况,分析ErbB2在M1-CM促癌作用及AKT和ErK信号激活中的介导作用;通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、western blotting 和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 M1-CM 和 TNF-α 对 SCC25 和 CAL27 细胞中GDF15表达的影响;western blotting检测GDF15基因敲除后M1-CM对p-ErbB2蛋白表达水平的影响。结果1.OSCC中M1型和M2型巨噬细胞的浸润特征及其与临床病理特征的关系分析本研究筛选出TCGA数据库中OSCC转录组测序数据,利用quanTIseq算法评估OSCC中的免疫细胞组分。结果表明,OSCC癌组织中M1型和M2型巨噬细胞在10种免疫细胞中占比居前两位,其浸润程度均显著高于癌旁正常组织。同时将巨噬细胞浸润数据和OSCC患者临床特征信息结合分析发现,M1型巨噬细胞浸润水平与OSCC组织病理学分级和淋巴结分期呈显著正相关,说明M1型巨噬细胞与较差的临床预后相关。此外,OSCC癌组织中M1/M2型巨噬细胞浸润得分比值显著高于癌旁组织,且随着临床分期的增加呈现逐渐升高趋势。2.M1型巨噬细胞对OSCC细胞生物学行为及体内成瘤效应的影响M1向巨噬细胞极化并鉴定后,制备M1-CM。CCK-8实验、EdU实验和迁移侵袭实验结果表明,相较于BM,M1-CM显著促进了 SCC25细胞的增殖能力,以及SCC25和CAL27细胞的迁移和侵袭能力,但对二者的凋亡没有影响。相较于BM培养的SCC25细胞,M1-CM刺激的SCC25细胞显示出更强的成瘤能力,免疫组织化学染色结果显示肿瘤组织中增殖标记物Ki67的表达显著升高。M1型巨噬细胞与SCC25细胞按较低比例混合植入亦显著促进了 SCC25细胞的皮下成瘤能力。3.M1型巨噬细胞促癌的作用机制研究基于TCGA数据库中33种主要癌症转录组测序数据进行泛癌分析,结果显示GDF15在包括HNSCC在内的1 1种类型肿瘤组织中过表达;生存分析发现GDF15的表达与6种癌症类型患者的生存均呈负相关。探究GDF15在HNSCC/OSCC中的表达及其临床意义发现,GDF15的异常表达与HNSCC/OSCC患者的组织病理学分级、TNM分期和淋巴结分期有相关性。此外,OSCC免疫浸润分析发现GDF15与M1型巨噬细胞浸润程度相关。体外实验结果显示,M1-CM可激活OSCC细胞中ErbB2/AKT/ErK信号通路,ErbB2受体抑制剂可抑制M1-CM激活的AKT和ErK的磷酸化,同时抑制M1-CM诱导的增殖、迁移和侵袭,说明M1-CM对OSCC细胞中PI3K/AKT和MAPK/ErK信号通路的激活和促瘤效应由ErbB2介导。而M1-CM可促进GDF15基因和蛋白表达及分泌,TNF-α也可促进GDF15基因的表达,当GDF15基因敲除可部分抑制M1-CM激活的ErbB2磷酸化,说明GDF15部分参与了 ErbB2的磷酸化。结论M1型巨噬细胞通过激活GDF1 5/ErbB2/AKT/ErK信号通路促进口腔鳞状细胞癌的生长和侵袭