论文部分内容阅读
平菇（Pleurotus ostreatus）其子实体的形成和分化是一个非常复杂的过程,这一过程中所需要的营养和外界条件已经有很多的研究,比如温差、光照等,但是在分子方面研究很少。丝状真菌存在着NADPH氧化酶（NADPH Oxidase,NOXA）,该酶通过调节活性氧（ROS）的合成,在子实体的分化和发育过程中起关键作用。平菇中已经验证了也存在这种酶,因此推测这种酶在平菇的子实体的形成和分化的关键基因。本实验用本实验室保存的发夹质粒NOXA-P8和质粒PAN7-1共转化平菇天达300,用潮霉素筛选阳性转化子,通过性状和分子分析,确定了基因NOXA基因的功能。克隆了构巢曲霉乙醇脱氢酶的启动子并构建了重组表达载体pEGFP-C1-alcA,遗传转化黑根霉和平菇,通过荧光显微镜观察,验证了乙醇脱氢酶启动子可以在黑根霉和平菇中启动外源基因的表达,并可以被抑制和诱导外源基因的表达。研究结论如下:1.用PEG-CaCl2介导的原生质体转化的方法,介导发夹质粒NOXA-P8和质粒PAN7-1共转化平菇天达300,潮霉素初筛后,经过PCR验证挑取了10个转化子,这10个转化子在平板上的生长速度均低于对照菌株,随机挑选了6个转化子进行半定量PCR,验证了转化子1、3、5中的基因NOXA的表达量有降低,均下降了50%左右,而其余三个转化子的基因NOXA的表达量没有明显变化。测定的H2O2、羟自由基、超氧阴离子的含量与半定量PCR的结果一致,转化子1、3、5的含量都有降低,与野生菌株相比差异显著。NBT染色转化子和野生菌株也验证了半定量PCR的结果,野生菌株的颜色和RNAi没有效果的基本一样,而转化子1、3的颜色很浅。在平板上出菇可以发现野生菌株全部形成了子实体,除了转化子3没有形成子实体,其他的9个转化子均有子实体形成,证实了基因NOXA是平菇形成子实体的关键基因。2.合成的构巢曲霉乙醇脱氢酶启动子,替换了质粒pEGFP-C1上的黄瓜花叶病毒启动子,成功构建了以乙醇脱氢酶启动子启动的重组表达质粒pEGFP-C1-alcA。3.采用脂质体转化方法,用重组表达质粒pEGFP-C1-alcA遗传转化黑根霉,通过荧光观察和分子验证,证明绿色荧光蛋白在黑根霉中得到表达。并证明了乙醇脱氢酶启动子可以在诱导培养基上启动GFP基因的表达,而在抑制培养基上抑制GFP基因的表达。4.用PEG-CaCl2介导的原生质体转化的方法,介导重组表达质粒pEGFP-C1-alcA和质粒PAN7-1共转化平菇天达300,潮霉素初筛后,挑取的转化子经过分子验证后,分别在诱导培养基和抑制培养基上培养,经过荧光观察,在诱导培养基上的菌丝可以观察到绿色荧光,但是在抑制培养基上培养的菌丝没有观察到绿色荧光,证明了在平菇中乙醇脱氢酶启动子可以被诱导或抑制外源基因的表达,为以后研究NOXA基因奠定了基础。