论文部分内容阅读
牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)又称为牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus-1,BHV-1)，是一种能够引起牛呼吸道炎症、结膜炎、阴道炎、龟头炎、母牛流产、免疫抑制等方面疾病的接触性病毒传染病。BHV-1属于疱疹病毒，α疱疹病毒亚科，能在人类和动物中间广泛传播的病毒。该病毒感染动物后，能在体内潜伏感染，使受感染动物会终身带毒(Turin et al.,1999)，而且该病毒能引起动物体免疫抑制，进而引起牛呼吸系统综合征等，会带来巨大的经济损失。根据BHV-1基因组分析，该病毒存在大量复制非必需基因。缺失这些基因，并不影响病毒的存活与增殖，仅会降低病毒毒力。可以通过将这些非必须基因替换为外源基因，表达外源蛋白。因此，牛传染性鼻气管炎病毒是理想的表达外源蛋白的活病毒载体。 口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒FMDV引起的，偶蹄动物间相互传播的急性、热性、高度接触性传染病。FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，单链正链RNA病毒。P1作为其保护性蛋白基因，可以诱导宿主动物产生中和抗体，将P1基因插入到缺失了的BHV-1基因组中，以BHV-1缺失株为载体，构建多价基因工程疫苗，可以预防FMD与BHV-1。由于FMDV各血清型间无交叉保护力，所以我们在病毒活载体中，加入了亚1型与A型FMDV的P1基因，希望达到一苗多防的目的。 本研究是将包含了亚1型与A型FMDV P1基因的载体，与BHV-1(TK-/gG-/EGFP+)进行同源重组并替换其中的EGFP基因。通过反向筛选，需要选取产生病变，但是不发出绿色荧光的病毒，即BHV-1(TK-/gG-/A1 P1/A P1)病毒。将重组后的病毒以日本大耳白兔为模型，开展动物实验，在兔体内研究该疫苗的免疫原性，为BHV-1与口蹄疫疫苗的开发奠定了基础，并为研制BHV-1病毒活载体疫苗提供参考。 本研究的具体内容如下： 1.构建含有外源基因与同源臂的转移载体 本实验中亚1型口蹄疫P1基因是由CMV启动，SV40 poly(A)终止，A型口蹄疫P1基因是由CMV启动，BGH poly(A)终止。我们是将亲本病毒BHV-1(TK-/gG-/EGFP+)中EGFP通过同源重组，置换为亚1型口蹄疫P1基因与A型口蹄疫P1基因，我们希望它们由启动子启动，终止子终止，高效表达亚1型与A型口蹄疫P1蛋白。所以，我们选择BHV-1(TK-/gG-/EGFP+)病毒基因组中EGFP基因上下游序列作为上下游同源臂。 2.将外源片段与亲本病毒基因组共转染，得到并纯化重组病毒 我们将病毒BHV-1(TK-/gG-/EGFP+)大量扩增，提取病毒基因组。将浓度与纯度都还比较好的基因组与线性化的转移载体共转染MDBK细胞，得到在显微镜下发生病变，但是荧光激发不能产生绿色荧光的病毒BHV-1(TK-/gG-/Asia1 P1/A P1)将病毒进行纯化。 3.对纯化后的病毒进行PCR与Western blot检测 我们将纯化后的病毒，从DNA水平与蛋白水平进行检测，进一步确定我们所筛选到的病毒为含有目的片段的病毒。 4.重组病毒在兔体内免疫效果的研究 我们根据不同免疫剂量和是否使用佐剂将实验动物分为七组，进行比较。通过皮下多点注射进行免疫，免疫后动物每周采集血清与鼻拭子。我们对血清样品进行中和试验，检测血清中抗IBRV的中和抗体。结果显示血清中和抗体效价最高达到1:45，且抗体效价和病毒接种剂量存在正相关性。同时佐剂可以显著增强中和抗体效价。我们对兔鼻拭子进行PFU测定，检测实验动物的排毒量。发现虽然有个别实验动物有流鼻涕与打喷嚏症状，但是并未向外界排毒。 为了检测血清中的抗口蹄疫P1基因的抗体，我们利用pET-28(a)作为载体分别表达了的亚1与A型FMDV的VP1蛋白，结果显示蛋白以包涵体形式表达。我们将其提取并纯化后，用其作为抗原包被ELISA板，检测血清中抗亚1与A型FMDV P1蛋白的ELISA抗体。结果显示ELISA抗体效价同样和接种病毒剂量呈正相关性，而且佐剂可以提高血清中ELISA抗体的效价。